Charakterisierung GATA-3-spezifischer DNAzyme und Analyse der therapeutischen Wirksamkeit in experimentellen Modellen des allergischen Asthma bronchiale

Das allergische Asthma bronchiale ist eine chronisch entzündliche Erkrankung der Atemwege begleitet von einer erhöhten Mukussekretion und Atemwegs-hyperreagibilität. Die häufigste Therapie basiert auf einer Kombination von inhalativen Kortikosteroiden (ICS) und langwirksamen β2-Sympathomimetika. Die...

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1. Verfasser: Dicke, Tanja Maria
Beteiligte: Garn, Holger (Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2009
Physiologische Chemie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Zusammenfassung:Das allergische Asthma bronchiale ist eine chronisch entzündliche Erkrankung der Atemwege begleitet von einer erhöhten Mukussekretion und Atemwegs-hyperreagibilität. Die häufigste Therapie basiert auf einer Kombination von inhalativen Kortikosteroiden (ICS) und langwirksamen β2-Sympathomimetika. Diese Medikamente wirken allerdings rein symptomatisch, verursachen unerwünschte Nebenwirkungen und sind bei einem Teil der Patienten nicht wirksam. In der vorliegenden Arbeit sollte daher ein neuer, kausal wirksamer und möglichst nebenwirkungsarmer Therapieansatz für das allergische Asthma bronchiale entwickelt werden. Als Zielmolekül der Interventions-strategie wurde der Transkriptionsfaktor GATA-3 gewählt, der durch seine Funktion bei der Differenzierung und Aktivierung von T-Helfer-2-Zellen (Th2) und der Expression in Eosinophilen, Mastzellen und natürlichen Killer T- (NKT-) Zellen eine zentrale Rolle bei allergischen Entzündungsreaktionen spielt. Transkriptionsfaktoren liegen intrazellulär vor und sind therapeutisch folglich schwierig zu adressieren. Antisense-Strategien stellen dafür eine neue Möglichkeit dar, da sie direkt mit der mRNA des Zielmoleküls interagieren. Als therapeutisches Werkzeug wurden von unserer Arbeitsgruppe entwickelte GATA 3-spezifische DNAzyme verwendet. Dabei handelt es sich um einzelsträngige Desoxyoligonukleotide mit hoher Spezifität für die GATA-3-mRNA und inhärenter RNA-spaltender katalytischer Aktivität. Eingesetzt wurden die GATA-3-spezifischen DNAzyme gd21 und hgd40, sowie das Kontroll-DNAzym ODNg. Letzteres besitzt die katalytische Sequenz, kann aber GATA-3-mRNA nicht binden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die GATA-3-spezifischen DNAzyme bezüglich ihrer Spezifität und möglichen Off-Target-Effekte zu charakterisieren, Nachweis-systeme zur Untersuchung von Stabilität und Bioverfügbarkeit zu entwickeln und die Wirksamkeit in experimentellen Modellen für allergische Atemwegsentzündungen zu untersuchen. Analysen zur Spezifität ergaben, dass gd21 nur die murine und hgd40 die humane, murine und Ratten-GATA-3-mRNA dosisabhängig schneiden können. Die katalytische Aktivität ist nur spezifisch für GATA-3-mRNA, auf andere mRNAs bzw. GATA-3-DNA wurde kein Einfluss beobachtet. Mit Fokus auf mögliche Off-Target-Effekte konnte in in vitro und in vivo Experimenten ausgeschlossen werden, dass die DNAzyme eine Aktivierung angeborener Immunmechanismen, insbesondere durch Interaktion mit dem Toll-like-Rezeptor-9 (TLR-9), bewirken. Für Untersuchungen zur Stabilität und Bioverfügbarkeit der GATA-3-spezifischen DNAzyme wurden ein sensitiver Hybridisierungs-ELISA und eine Anionenaustausch-Chromatographie-Methodik entwickelt. Mittels dieser Methoden konnte gezeigt werden, dass die verwendeten DNAzyme auch bei erhöhter Lagerungstemperatur langzeitig stabil sind. Der Nachweis von DNAzym im Serum nach lokaler Applikation in die Lunge bestätigt, dass DNAzym über die Lunge aufgenommen und somit bioverfügbar wird. Die in vivo Wirksamkeit von GATA-3-spezifischen DNAzymen wurde in tierexperimentellen Modellen der akuten allergischen Atemwegsentzündung untersucht. Sowohl eine präventive als auch eine therapeutische Applikation von GATA-3-spezifischen DNAzymen führte zu einer Reduktion der Entzündungsreaktion in der Lunge und zu einer deutlichen Verbesserung der Atemwegsreaktivität. Im direkten Vergleich von hgd40 mit dem ICS Budesonid wurde gezeigt, dass die Wirkungen der DNAzyme auf die akute allergische Atemwegsentzündung vergleichbar oder besser zu denen des Budesonids sind. Auch in einem Modell für chronisch allergisches Asthma bronchiale, das noch besser die Situation des humanen Asthma bronchiale widerspiegelt, konnten positive therapeutische Effekte nachgewiesen werden, die hier auch eine Verminderung der Umbauprozesse der Atemwege (Remodelling) einschlossen. Schlussfolgernd kann festgestellt werden, dass die intranasale Applikation von GATA 3-spezifischen DNAzymen eine viel versprechende neue Therapieform für allergisches Asthma bronchiale darstellen kann, deren Wirksamkeit nun bei humanen Asthmapatienten bestätigt werden muss.