Entwicklung einer biosensorischen Durchfluss-Messmethode für die Qualitätskontrolle von pflanzlichen Arzneimitteln und gesundheitsrelevanten Nahrungsbestandteilensowie Untersuchungen zum Einfluss von ionisierender Strahlung auf Cysteinsulfoxide und Proteine

Im Sinne der präventiven Medizin und angesichts des hohen Bedarfs an präparierten Naturprodukten stehen Heilpflanzen zunehmend höher im Kurs. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb eine spezifische Bestimmungsmethode (FIA-Biosensor) für die heilsam wirkenden S-haltigen Aminosäuren wie die Cystein...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Tannous, Fadi
Beteiligte: Keusgen, Michael (Professor Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2008
Pharmazeutische Chemie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Beschreibung
Zusammenfassung:Im Sinne der präventiven Medizin und angesichts des hohen Bedarfs an präparierten Naturprodukten stehen Heilpflanzen zunehmend höher im Kurs. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb eine spezifische Bestimmungsmethode (FIA-Biosensor) für die heilsam wirkenden S-haltigen Aminosäuren wie die Cysteinsulfoxide aus der Gattung Allium entwickelt. Mit dem wässrigen Extrakt der Proben konnte man im Minutentakt Messungen durchführen und eine Aussage im ppm-Bereich über die gesamten Cysteinsulfoxide in der Probe machen. Zur Entwicklung des FIA-Biosensors wurden die bei einer Knoblauchzerquetschung ausgelösten biochemischen Vorgänge simuliert und in einer Apparatur technisch umgesetzt. Es handelt sich hierbei um die enzymatische Umsetzung (C-S-Lyase) der nicht-proteinogenen Aminosäuren bzw. ihrer Vorstufen (Alliin, Isoalliin, Propiin, Methiin) in dem stark riechenden und reizenden Stoff Cystein sowie um andere Produkte, wie Pyruvat und Ammoniak. Das Ammoniak wird unter der Wirkung der in der Vacula vorhandenen Alliinase [EC 4.4.1.4] in einem Verhältnis 1:1 zum jeweiligen Cysteinsulfoxid umgesetzt. Deshalb wurde Ammoniak als Schlüssel für das Aufspüren von Cysteinsulfoxiden im FIA-Biosensor verwendet. Diese enzymatische Reaktion wurde dem Biosensor dank eines Puffersystems ermöglicht, dessen optimiertes alkalisches Medium (pH 10,5) das freigesetzte Ammoniak in ein detektierbares fluoreszierendes Derivat überführt. Der eigens dafür entwickelte Enzymreaktor schuf die Voraussetzung dafür, das 1:10-verdünnte Enzym auf einem Substrat bzw. Träger, nämlich dem Glycoprotein (Concanavalin-Agarose/Con-A), immobilisieren und optimieren zu können. Die Anordnung erfolgte in einem Fördersystem (FIA). Innerhalb der 3- bis 4-minütigen Messung konnte man die gesamten Cysteinsulfoxide in wässrigem (40 μl als Probenvolumen) Extrakt aus der Pflanze bestimmen, und dies ohne langwierige Umständlichkeiten wie Vor-Derivatisierungsschritte und Inkubationen, auf die bei dem hierzu eingesetzten HPLC oder vergleichbaren Analysesystemen zurückgegriffen wird. Durch die weitere Optimierung und Ankupplung an einen Autosampler konnte man Dutzende oder sogar Hunderte von Proben in unschlagbarer Zeit auf den gesamten Gehalt von Cysteinsulfoxiden (CS) analysieren und in eine chemotaxonomische Datenbank zuverlässig einordnen. Schwefelhaltige Proteine wie CS gelten als sehr empfindlich gegenüber Strahlung. Insofern war es möglich, insbesondere in den unverarbeiteten Varianten des Allium sativum (nämlich normalen frischen Knoblauchzehen), ein aussagekräftiges Ergebnis ab 1 kGy mit FIA-Biosensor zu erzielen, wobei mit 5 kGy und 3,5 kGy jeweils 50 % bzw. 70% CS-Verlust notiert werden konnten. Eiklar als gesunder Proteinspender, sowohl in purer Form als auch als Inhaltsstoff eines Präparates, stehen als weiteres Subjekt, ebenfalls aufgrund ihrer hochwertigen Nahrungsbestandteile, im Fokus der vorliegenden Arbeit. Die Eiklarvarietäten wurden in dieser Arbeit mit zwei Techniken auf strahlungsinduzierte Veränderungen untersucht. Einerseits war es möglich, mit CZE unter UV-Detektion sind einige signifikante Strahlungsänderungen bei flüssigem Eiklar festzustellen. Insbesondere verzeichnete man die Anfälligkeit von Lysozym (MW: 14,3), wobei eine 70prozentige Abnahme der Absorption bei 3 kGy notiert wurde. Ebenso zeigten andere undefinierte Proteine, die größere Migrationszeiten als Ovalbumin und Ovomocoid haben (über 76 k Dalton), eine ähnlich bedeutsame Abnahme in ihrer UV-Absorption. Zu verzeichnen war auch eine relativ proportionale Abhängigkeit der Änderungen bei der Abnahme der UV-Absorption mit ansteigenden Strahlendosen. Andererseits konnte eine signifikante Unterscheidung des bestrahlten flüssigen, frischen Eiklars über CZE-LIF erzielt werden (eine Abnahme der Fluoreszenz bei 3 kGy um 70% des Ausgangswertes). Mit Hilfe der CGE-Auftrennung war bei frischem, flüssigem Eiklar ein neuer Peak mit der Molarmasse im Bereich von 15 bis 23 kDalt bei mit 3 kGy bestrahlten Proben zu erfassen. Der neue Peak nahm mit steigender Strahlendosis, insbesondere bei 3; 4 kGy bis zu 100% seines Werts bei 1 kGy, zu und war bei SDS deutlicher als bei Nativ-CGE zu bewerten. Mit der MIR-ATR-Methode unterschied man Spektren der pasteurisierten Proben von denen der unbehandelten und den mit 10 kGy bestrahlten Proben. Insbesondere im Bereich der NH-Schwingungen bei 3600 bis 3200 cm-1 und im Fingerprintbereich bei 1390 sowie bei 1278 und 1252 cm-1 waren Unterschiede erkennbar.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2009.0025