Gentransfer und –regulation mit adeno-assoziierten Virusvektoren

Zusammenfassung Das Vektorsystem, basierend auf den adeno-assoziierten Viren, ist ein hoch attraktives Vektorsystem mit geringer biologischer Sicherheitsstufe (S1), da es keine bekannten Pathogenitätsfaktoren aufweist. Das Vektorsystem hat ein sehr breites Wirtsspektrum und ist aus diesem Grund un...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Pinkenburg, Olaf
Beteiligte: Vogelmeier, Claus (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2007
Innere Medizin
Schlagworte:
AAV
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Zusammenfassung Das Vektorsystem, basierend auf den adeno-assoziierten Viren, ist ein hoch attraktives Vektorsystem mit geringer biologischer Sicherheitsstufe (S1), da es keine bekannten Pathogenitätsfaktoren aufweist. Das Vektorsystem hat ein sehr breites Wirtsspektrum und ist aus diesem Grund universell einsetzbar. Daher sollten zuerst grundlegende Eigenschaften des Vektorsystems charakterisiert werden, anschließend sollte das TET-ON-OFF-System sowie die RNAi-Technologie mit dem Vektorsystem verknüpft werden. Schließlich sollte im Tierversuch unter in vivo Bedingungen ein Gentransfer gezeigt werden. Es konnten grundlegende Eigenschaften wie der zeitliche Ablauf des Gentransfers bestimmt werden. Hierbei konnte die Aufnahme der Viren sowie die daraus resultierende Genexpression in einem zeitlichen Verlauf genau dargestellt werden. Des Weiteren war es möglich, die Stabilität der Genexpression nach der Transduktion sowie die Menge an Integrationen zu bestimmen. Ferner wurde gezeigt, dass es möglich ist, stabile Zelllinien mit rekombinanten AAV herzustellen. Es war sogar möglich, das Tetracyclin-regulierbare System mit dem AAV-Vektorsystem zu kombinieren. Hierbei konnte im TET-OFF-System eine fast 7-fach stärkere Induktion der Luziferase als im TET-ON-System erreicht werden. Das TETON-System zeigte eine 4-fach höhere Basalaktivität im Vergleich zum TET-OFFSystem.Mit dem TET-OFF-System war es auch möglich, das antimikrobielle Peptid hCAP18 herzustellen und immunchemisch nachzuweisen. Wie beim TET-System gelang es gleichermaßen, die RNAi-Technologie mit dem AAV-System zu verbinden, wobei eine Dosis- sowie auch eine Zeit-abhängige Regulation der Luziferaseexpression gezeigt werden konnte. Hierfür wurde eine siRNA gegen Luziferase sowie eine Kontroll-siRNA im Überexpressionsmodell verwendet, wobei die Luziferase um 95 % herunterreguliert werden konnte. Das RNAi-System wurde ebenfalls dazu genutzt, um die IL8-Expression in Epithelzellen nach TNFα-Stimulation durch Reduktion des p65-Proteins zu senken, um somit eine Verringerung des Entzündungsfaktors zu erzielen. Eine verstärkte Expression des hCAP18 sowie seine Sezernierung in das Medium konnte mit zwei verschiedenen rekombinanten AAV-Konstrukten sowohl in HEK-293 Zellen als auch in primären HBE Zellen gezeigt werden. Im Tierversuch wurde ein selbst komplementierendes AAV für den Gentransfer des hCAP18 eingesetzt. Im Modell der regionalen Ischämie in den Kaninchenhinterläufen bestätigten sich die angiogenen Eigenschaften des hCAP18/LL37 nach viralem Gentransfer durch höhere Durchflussgeschwindigkeit und Kapillardichte im behandelten Gewebe.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2007.0642