Identifizierung und Charakterisierung des HCMV Portal Proteins pUL104

Die HCMV DNA-Verpackung beruht auf der Spaltung konkatemerer DNA durch die virale Terminase, deren Interaktion mit einem im Kapsid vorliegenden Portalprotein und der anschließenden Translokation der DNA in das Kapsid. In der vorliegenden Arbeit konnte pUL104 als das HCMV Portalprotein identifiziert...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
1. Verfasser: Dittmer, Alexandra
Beteiligte: Radsak, Klaus (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2006
Hygiene u. Med. Mikrobiologie mit Medizinaluntersuchungsamt
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Zusammenfassung:Die HCMV DNA-Verpackung beruht auf der Spaltung konkatemerer DNA durch die virale Terminase, deren Interaktion mit einem im Kapsid vorliegenden Portalprotein und der anschließenden Translokation der DNA in das Kapsid. In der vorliegenden Arbeit konnte pUL104 als das HCMV Portalprotein identifiziert werden. Über indirekte Immunfluoreszenz konnte gezeigt werden, dass pUL104 über ein nicht lineares, endogenes NLS verfügt und bei solitärer Expression im Zellkern vorliegt. In infizierten Zellen wird pUL104 in die Replikationszentren rekrutiert und erscheint spät nach Infektion als Bestandteil der Virionen im Zytoplasma. Nach Aufreinigung eines monospezifischen polyklonalen Antikörpers konnte pUL104 in infizierten Zellen durch Immunpräzipitationen als Protein von 75 kDa identifiziert werden, das auch als Dimer von 150 kDa vorliegt. Unter nativen Bedingungen liegen beide Formen als Komplex vor. Bei einer Zellfraktionierung zeigte sich ebenfalls eine sowohl nukleäre als auch zytoplasmatische Verteilung. Weiterhin konnte pUL104 als Strukturprotein in extrazellulären Virionen nachgewiesen werden. Dies konnte durch Immunogoldfärbung von Ultradünnschnitten infizierter Zellen weiter eingegrenzt werden, wo sich pUL104 einzeln an Kapsiden beobachten ließ. Untersuchungen zur Struktur von pUL104 zeigten, dass rekombinant exprimiertes rpUL104 sowohl in der Sedimentation über einen Sucrosegradienten als auch in der Gelpermeationschromatographie als hochmolekularer Komplex von mindestens 670 kDa vorliegt. Auch bei Cross-Linking- und Einzelpartikel-Analysen liegt rpUL104 als Oligomer vor, wobei bei letzterem eine Ringstruktur mit einer tonnenförmigen Seitenansicht auszumachen war. Eine Interaktion mit pUL56, der großen Terminase-Untereinheit, ließ sich sowohl durch in vitro Bindungsexperimente als auch durch Co-Immunpräzipitationen in vivo nachweisen. Diese konnte durch den HCMV Inhibitor Cl4RB, ein Benzimidazol-D-Ribonukleosid, unterbunden werden. Weiterhin konnte eine Bindung an dsDNA gezeigt werden. Sowohl die strukturellen als auch die funktionalen Anforderungen an ein Portalprotein werden damit durch pUL104 erfüllt. Durch den Einsatz von UL104 spezifischer RNAi konnte eine Verminderung der pUL104 Expression und auch der HCMV Replikation erreicht werden. Die EM-Analyse von Ultradünnschnitten infizierter Zellen zeigte hierbei eine Akkumulation leerer Kapside im Zellkern sowie einen Mangel an infektiösen Virionen im Zytoplasma. Dies zeigt, dass pUL104 für die DNA-Verpackung notwendig ist. Zusammenfassend handelt es sich bei pUL104 um ein Kapsid-assoziertes Oligomer, das mit der HCMV Terminase interagiert und für die DNA-Verpackung essentiell ist.