Ermittlung der m-RNA-Expressionsmuster der c-jun, c-fos und c-myc Proto-Onkogene nach ex vivo Ballondilatation von Schweinekarotiden mittels semiquantitativer RT-PCR.

Ziel der Arbeit war die Ermittlung der mRNA Muster dreier Proto-Onkogene nach Ballondilatation in einem serumfreien Modell mit Hilfe einer zu etablierenden semiquantitativen RT PCR ohne die Verwendung radioaktiver oder fluoreszierender Substanzen. Zunächst konnten dafür die noch nicht bekannte c-jun...

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Main Author: Steinhagen, Sandra
Contributors: Alfke, Heiko (Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2005
Klinik für Strahlentherapie
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Ziel der Arbeit war die Ermittlung der mRNA Muster dreier Proto-Onkogene nach Ballondilatation in einem serumfreien Modell mit Hilfe einer zu etablierenden semiquantitativen RT PCR ohne die Verwendung radioaktiver oder fluoreszierender Substanzen. Zunächst konnten dafür die noch nicht bekannte c-jun und c-myc Gene des Schweins in kurzen Sequenzabschnitten erfolgreich ansequenziert werden. Um für die Sequenzierung geeignete homogene Fragmente zu erhalten, wurde mit Primern, die durch Vergleiche bekannter c-myc bzw. c-jun Sequenzen anderer Spezies konstruiert wurden, eine spezifische PCR durchgeführt. Anschließend konnten die Fragmente aus den Agarosegelen in sehr guter Qualität eluiert werden, wobei diese Methode bisher nicht genutzt wurde und hier zunächst optimiert werden mußte. Als problematisch erwiesen sich in den Vorversuchen die anfangs verwendeten Schlachthofgefäße. Mechanische Belastungen der Gefäße während der Entnahme aus den Schweinen im Schlachthof waren nicht zu verhindern. Um eine Verzerrung der Ergebnisse zu vermeiden, wurden für die semiquantitativen PCRs sowie für den Nachweis der Primerspezifität ausschließlich Karotiden verwendet, die unter OP Bedingungen durch Tierärzte des MPI Bad Nauheim entnommen wurden. Diese Gefäße wurden nach einer standardisierten Methode präpariert, dilatiert sowie teilweise mit Kollagenase A behandelt und anschließend inkubiert. Die RNA-Isolierung erfolgte auf chemischen Weg mittels Phenollösungen. Auch dieses Protokoll mußte hier erst optimiert werden. Zudem konnte ein effizientes Verfahren der Homogenisierung, alternativ zur Zerkleinerung, mit Hilfe von Ultraturax oder Ultraschall etabliert werden. Für die nachfolgenden PCRs konnten spezifische Primer entsprechend den beiden sequenzierten Abschnitten sowie für c fos, dessen Sequenz der Gendatenbank entnommen wurde, konstruiert werden. Nachdem der Nachweis der Primerspezifität gelang, konnten mit semiquantitativen PCRs, die in Vorversuchen optimiert wurden, Rückschlüsse auf die mRNA Spiegel in den Ausgangsproben gezogen werden. Die im Verlauf dieser Arbeit entwickelte Methode zur semiquantitativen Analyse von Genexpressionen mittels RT PCR ist gut geeignet, um unterschiedliche mRNA Spiegel nachzuweisen. Voraussetzungen sind, daß man Vergleiche zum Zeitpunkt des exponentiellen Reaktionsverlaufs der PCR trifft und daß gleiche Mengen an cDNA in die Reaktion einsetzt werden. Als Ergebnis der semiquantitativen PCRs fand sich eine verminderte Genablesung des c jun Gens bei den vom Endothel befreiten Gefäßen bei einer Dilatation und Inkubation in serumfreien Medien sowie eine Erhöhung der c fos Expression bei Gefäßen ohne Kollagenasebehandlung, die jedoch aufgrund der geringen Fallzahl nicht statistisch signifikant war. Die bislang unter in vivo-Bedingungen – d.h. unter dem Einfluß von Faktoren des Serums und aus Thrombozyten - beschriebene Steigerung der c-jun- und c-myc-Genexpression endothelhaltiger Gefäße konnte nicht nachgewiesen werden. Weiterhin zeigte sich eine deutliche Hochregulation des Aktin Gens in beiden Versuchsreihen, eine Hochregulation des sm MLCK Gens sowie eine verminderte Expression des GAPDH Gens bei den endothellosen Gefäßen. Diese nachgewiesenen Veränderungen der mRNA-Spiegel der Proto-Onkogene jun, myc und fos nach Ballondilatation wurden erstmalig in einem thrombozyten- und serumfreien Tiermodell beobachtet. Bisher in der aktuellen Literatur beschriebene Modelle sind immer in serum- oder thrombozytenhaltigem Milieu durchgeführt worden. Damit ist das Ergebnis im Einklang mit den diesbezüglichen aktuellen Veröffentlichungen in der Literatur. Zusätzlich konnte mit histologischen Präparaten von den Gefäßen in HE- und EvG/Elastica-Färbungen belegt werden, daß sowohl dilatierte als auch Kontrollgefäße nicht bei der Präparation zerstört wurden und die Gefäßwand nach Dilatation intakt war. Beweise für eine Denudation zeigten sich nicht.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2006.0563