Antisense-Inhibition der bakteriellen RNase P

Ziel der vorliegenden Arbeit war die in vitro- und in vivo-Inhibition bakterieller RNase P mit Antisense-Oligonukleotiden (AS-ON). RNase P ist ein essentielles Ribonukleoproteinenzym, das in allen drei Reichen des Lebens für die Reifung der ptRNAs zuständig ist. Für die Inhibitionsversuche wurde je...

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Main Author: Grügelsiepe, Heike
Contributors: Hartmann, Roland K., (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2005
Pharmazeutische Chemie
Subjects:
PNA
LNA
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Ziel der vorliegenden Arbeit war die in vitro- und in vivo-Inhibition bakterieller RNase P mit Antisense-Oligonukleotiden (AS-ON). RNase P ist ein essentielles Ribonukleoproteinenzym, das in allen drei Reichen des Lebens für die Reifung der ptRNAs zuständig ist. Für die Inhibitionsversuche wurde je eine RNase P RNA des Strukturtyps A und B ausgewählt (Typ A: Escherichia coli RNase P RNA; Typ B: Mycoplasma hyopneumoniae RNase P RNA). Bei beiden Strukturtypen bindet die ptRNA an die sogenannte CCA-Bindungsstelle in der P15-Schleife der RNA-Untereinheit als Voraussetzung für eine effiziente Abspaltung der 5´-Flanke der ptRNA. Die CCA-Bindungsstelle ist für die ptRNA-Reifung also von zentraler Bedeutung und sie ist gut zugänglich, da sie an der Oberfläche des Holoenzyms liegt. Die Sequenzen in der Nähe der CCA-Bindungsstelle sind bei verschiedenen Bakterienstämmen nicht hoch konserviert, was die Möglichkeit bietet, AS-ON spezifisch für einen Bakterienstamm oder eine Subgruppe von Bakterien zu konzipieren. Außerdem ist in eukaryontischen P RNAs keine CCA-Bindungsstelle bekannt. Dies alles macht die CCA-Bindungsstelle zu einem interessanten target für Antisense-Strategien zur Bekämpfung pathogener Bakterien. Ausgangspunkt waren haarnadelförmige RNA-AS-ON die teilweise komplementär zur CCA-Bindungsregion der E. coli RNase P RNA und in Anlehnung an ein in E. coli natürlich vorkommendes Antisense-Prinzip entworfen worden waren. Der Versuch, die Strategie der haarnadelförmigen AS-ON auf die Typ B-RNase P RNA von Mycoplasma hyopneumoniae zu übertragen, schlug fehl. Untersuchungen zum Wirkmechanismus der AS-ON auf die E. coli-RNase P RNA zeigten, dass ein einzelsträngiges RNA-AS-ON (RNA-15mer), das nur aus dem zur CCA-Bindungsstelle komplementären Teil des haarnadelförmigen Inhibitors bestand, ein deutlich höheres Inhibitionspotential aufwies. Im weiteren Verlauf wurde das RNA-15mer als Ausgangspunkt für Optimierungen der E. coli-spezifischen Inhibitoren gewählt. Veränderungen in der Länge der Oligonukleotide führten zu dem effektivsten Inhibitor (RNA-14mer, Ki-Wert = 2,2 nM). Da die AS-ON langfristig in vivo eingesetzt werden sollten, wurde im zweiten Teil der Arbeit das Inhibitionspotential Nuklease-stabilisierter Analoga des RNA-14mers untersucht. Für das LNA-14mer (Locked Nucleic Acid) und das RNA 14mer wurde ein vergleichbarer Ki-Wert gefunden, gefolgt von der PNA-Variante (Peptide Nucleic Acid) und DNA-Variante. Um die Spezifität der 14mere zu adressieren, wurden sie an anderen bakteriellen RNase P RNAs getestet, die sich in ihrer Sequenz im Bereich der P15-Region geringfügig von der E. coli-RNase P RNA unterscheiden. Dabei stellte sich heraus, dass die PNA-Variante spezifischer als das RNA-14mer und beide deutlich spezifischer als das LNA-14mer waren. Eine Untersuchung des Assoziationsverhaltens der vier sequenzgleichen 14mere ergab die höchste Assoziationsrate für das PNA-Analogon, gefolgt von der LNA-, RNA- und DNA-Variante. In Bleispaltungsversuchen konnte der Nachweis geführt werden, dass die Inhibition tatsächlich über einen Antisense-Mechanismus abläuft und So wurde für alle vier 14mere die Invasion in die E. coli-P RNA gezeigt, bei der die Helix P15 aufgebrochen wird und es zur Bildung einer Hybridhelix über die gesamte Länge des 14mer-Inhibitors kommt. Aufgrund seiner hohen Assoziationsrate, guten Affinität und Spezifität wurde das PNA-Oligomer für die in vivo-Versuche ausgewählt. PNA-Oligomere können auf Grund der gleichen Kopplungschemie unproblematisch mit invasiven Peptiden verknüpft werden, die die Durchlässigkeit der bakteriellen Zellhüllen für AS-ON verbessern. Im dritten Teil der Arbeit wurde die PNA-Variante an zwei verschiedenen E. coli-Stämmen auf ihr in vivo-Inhibitionspotential untersucht. Das PNA-14mer wurde mit zwei verschiedenen linker-Varianten (dem neuen Glycin und dem Standard AEEA-linker), an das invasive Peptid KFFKFFKFFK gekoppelt. Tests in dem in vitro Standardassay legten nahe, dass weder einer der linker noch das Peptid einen signifikant störenden Einfluss auf die Inhibitionswirkung haben. In in vivo-Experimenten mit dem E. coli-Wildtyp K12 in 10% LB-Medium konnte bei einer Konzentration von 10 µM des PNA-Peptid-Konjugats mit dem Glycin-linker keine Koloniebildung mehr nachgewiesen werden, während das AEEA-linker-Konjugat das Wachstum nur partiell hemmte. Die Inhibitoren zeigten eine qualitativ sehr ähnliche, jedoch stärker ausgeprägte Hemmwirkung auf den LPS-defizienten Stamm AS19. Die unterschiedliche Wirksamkeit veranschaulichte die Bedeutung der äußeren Zellmembran als Hindernis für die zelluläre Aufnahme der PNA-Peptid-Konjugate. Die Ergebnisse zeigen, dass über die Kopplung solcher Peptide die Aufnahme von AS-ON erheblich verbessert werden kann. Die Aufnahme in die Zelle scheint sehr effizient zu erfolgen, da bereits nach 10 min Inkubationszeit in Anwesenheit einer 10 µmolaren Konzentration des PNA-G-Peptids fast keine Koloniebildung mehr beobachtet wurde.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2005.0145