Untersuchungen zur Topologie der Glycosylphosphatidylinositol-Biosynthese in Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazellulär lebendes, parasitisches Protozoon mit großer medizinischer Bedeutung vor allem in zwei Fällen: Zum einen bei Erstinfektion während einer Schwangerschaft, hier kann es zur Schädigung des Fötus kommen, zum anderen als opportunistischer Krankheitserreger...

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Bibliographic Details
Main Author: Kimmel, Jürgen
Contributors: Lingelbach, Klaus (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2004
Hygiene u. Med. Mikrobiologie mit Medizinaluntersuchungsamt
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazellulär lebendes, parasitisches Protozoon mit großer medizinischer Bedeutung vor allem in zwei Fällen: Zum einen bei Erstinfektion während einer Schwangerschaft, hier kann es zur Schädigung des Fötus kommen, zum anderen als opportunistischer Krankheitserreger bei immunsupprimierten Patienten (z. B. AIDS), hier kann eine Reaktivierung von Dauerstadien zum Tod führen. Einen Ansatzpunkt zur Bekämpfung der Parasiten stellt ein spezieller Stoffwechselweg dar, die Glycosylphosphatidylinositol- (GPI-) Biosynthese. GPIs bestehen aus einer konservierten hydrophilen Glycan-Grundstruktur, die durch Seitenketten modifiziert werden kann, und einem hydrophoben Inositol-Phospholipid. Wie bei einer Vielzahl anderer parasitärer Protozoen sind auch bei T. gondii die Hauptoberflächenproteine durch GPIs in der Zelloberfläche verankert, eine Blockierung der GPI-Biosynthese führt zum Absterben der Parasiten. Um bei therapeutischen Ansätzen jedoch nur die Parasiten zu bekämpfen und die in den Wirtszellen ebenfalls stattfindende GPI-Biosynthese nicht zu beeinflussen, sind detaillierte Kenntnisse über diesen Stoffwechselweg nötig. Es wurde ein System aus permeabilisierten Tachyzoiten von T. gondii entwickelt und erstmals die Verteilung von GPI-Ankervorläufern und weiterer GPI-Biosyntheseintermediate über die Membran des endoplasmatischen Reticulums (ER) untersucht. Durch hypotone Behandlung wird die Zellmembran effektiv permeabilisiert, das ER bleibt bei dieser Behandlung intakt. Dieses System wurde genutzt, um GPIs mit verschiedenen radioaktiven Vorläufermolekülen (Zuckernukleotiden) zu markieren. Die von permeabilisierten Toxoplasmen gebildeten GPI-Intermediate wurden anhand spezifischer enzymatischer Behandlungen und chemischer Hydrolysen charakterisiert und mit bereits bekannten Daten verglichen. Dabei wurde festgestellt, daß die hydrophilen Komponenten der GPI-Intermediate mit den beschriebenen Strukturen übereinstimmen. Außerdem konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden, daß vor Einsetzen der Mannosylierungs-Schritte eine Acylierung am Inositol von GlcN-PI zu GlcN-(acyl)-PI erfolgt. Anschließend an die radioaktive Markierung der Glycolipide wurde mit Hilfe des Enzyms PI-PLC, das zwischen hydrophilem und hydrophobem Anteil der GPIs spaltet, die Orientierung der GPI-Biosyntheseintermediate in der ER-Membran untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß sowohl frühe, als auch höher glycosylierte Intermediate und sogar GPI-Ankervorläufer zum überwiegenden Teil eine cytoplasmatische Orientierung in der ER-Membran aufweisen. Im Zusammenhang mit transienter Acylierung des Inositolringes scheint ein mehrfacher Wechsel der verschiedenen Intermediate über die ER-Membran ("flip-flop") möglich. Erstmals konnte hier gezeigt werden, daß derart große GPI-Ankervorläufer mit einer zusätzlichen hydrophilen Seitenkette, bestehend aus N-Acetyl-Galactosamina1-4Glucose, eine Lipid-Doppelmembran überqueren.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2005.0117