Phosphorylierung und Gap Junctions - Charakterisierung der Interaktion von Connexin 43 mit der Ubiquitin-Protein-Ligase Nedd4

Das Gap Junction Protein Connexin 43 (Cx43) ist ein integrales Membranprotein mit einer sehr kurzen Halbwertszeit, dessen Abbau am Lysosom sowie am Proteasom erfolgt. Die Funktion von Cx43 wird über posttranslationale Modifikationen wie Ubiquitinierung und Phosphorylierung reguliert. Die Phosphoryli...

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Main Author: Leykauf, Kerstin
Contributors: Renkawitz-Pohl, Renate (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2004
Biologie
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Das Gap Junction Protein Connexin 43 (Cx43) ist ein integrales Membranprotein mit einer sehr kurzen Halbwertszeit, dessen Abbau am Lysosom sowie am Proteasom erfolgt. Die Funktion von Cx43 wird über posttranslationale Modifikationen wie Ubiquitinierung und Phosphorylierung reguliert. Die Phosphorylierung des Proteins durch verschiedene Kinasen kann sich dabei positiv, aber auch negativ auf die interzelluläre Kommunikation über Gap Junctions auswirken. So ist z. B. die Phosphorylierung von Cx43 an den Serinresten S279 und S282 ausreichend, um eine Zell-Zell-Kommunikation zu inhibieren. Um die Auswirkungen einer S279/S282-Phosphorylierung von Cx43 näher zu untersuchen, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit der polyklonale Antikörper SA226P entwickelt und hergestellt. SA226P ist gegen ein Peptid gerichtet, das die beiden Serinreste S279 und S282 aus dem zytoplasmatischen Carboxy-Terminus (C-Terminus) von Cx43 in phosphorylierter Form enthält. In der indirekten Immunfluoreszenz unbehandelter Zellen wurde mit dem Antikörper SA226P eine schwache Färbung in den Zellkernen detektiert, die auf die Anwesenheit von S279/S282-phosphoryliertem Cx43 hinweist. Dagegen war eine durch den epidermalen Wachstumsfaktor bedingte S279/S282-Phosphorylierung stets an die Lokalisation von Cx43 in den Gap Junction Plaques gekoppelt. In Untersuchungen zu möglichen Bindungspartnern von Cx43 konnte die Ubiquitin-Protein-Ligase „neural precursor cell expressed, developmentally downregulated 4“ (Nedd4) als neuer Interaktionspartner identifiziert werden. Durch Pulldown-Analysen mit Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteinen der drei Protein-Protein-Interaktions-Domänen (WW1, WW2 und WW3) von Nedd4 wurde nachgewiesen, dass WW2 und WW3, nicht aber WW1 an den C-Terminus von Cx43 binden. Dass die WW2-Domäne spezifisch, aber in einer phosphorylierungsunabhängigen Weise an das PY-Motiv von Cx43 bindet, wurde mittels „Surface Plasmon Resonance“-Analysen gezeigt. Die Bindung der WW3-Domäne an andere Motive des C-Terminus von Cx43 scheint dagegen durch den Phosphorylierungsstatus von Cx43 reguliert zu werden. Diese zunächst in vitro gezeigte Interaktion von Cx43 und Nedd4, wurde in vivo in der indirekten Doppelimmunfluoreszenz durch eine Kolokalisation von Cx43 und Nedd4 in den multivesikulären Körpern bestätigt. Anhand der Ergebnisse mit Antikörper SA226P konnte gezeigt werden, dass die S279/S282-Phosphorylierung von Cx43 während der Mitose eine bedeutende Rolle spielt. So konnte eine Kolokalisation speziell von S279/S282-phosphoryliertem Cx43 mit Nedd4 und Ubiquitin in den Centrosomen von mitotischen Zellen nachgewiesen werden. Zudem wurden in mitotischen Zellen die Cx43-Proteine, die sich in Gap Junction Plaques an der Plasmamembran befanden, neben anderen Aminosäureresten in großem Maße an den beiden Serinresten S279 und S282 phosphoryliert. Es ist daher anzunehmen, dass die Phosphorylierung der beiden Serinreste S279 und S282 während der Mitose als eine Art Transportsignal fungiert, das zur gezielten Ubiquitinierung von Cx43 durch Nedd4 in den Centrosomen beiträgt. Experimente mit dem Proteasom-Inhibitor Lactacystin ergaben, dass ausschließlich phosphorylierte, und vor allem S279/S282-phosphorylierte Formen von Cx43, die in Gap Junction Plaques an der Plasmamembran lokalisiert sind, am Proteasom abgebaut werden. Damit weisen auch diese Ergebnisse darauf hin, dass eine bestimmte Hyperphosphorylierung von Cx43, die die beiden Serinreste S279 und S282 einschließt, zu einer Internalisierung der Gap Junction Kanäle führt, um am Proteasom abgebaut zu werden.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2005.0076