Antisense-Expression des Gens für den Rezeptor des humanen Lutein-Hormon-Releasing-Hormon (LHRH) in der humanen Ovarialkarzinomzelllinie EFO 21 mittels des Ecdysone-Systems

Das Ovarialkarzinom hat aufgrund fehlender Früherkennung immer noch eine sehr schlechte Prognose, so dass in der Therapie weitere Fortschritte benötigt werden. Es konnte gezeigt werden, dass in vitro eine Wachstumshemmung von humanen Ovarialkarzinomzelllinien durch die Zugabe von LHRH-Analoga erreic...

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Main Author: Backhus, Jan Hendrik
Contributors: Wagner, Uwe ( Professor Dr. med. ) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2004
Frauenheilkunde und Geburtshilfe
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Das Ovarialkarzinom hat aufgrund fehlender Früherkennung immer noch eine sehr schlechte Prognose, so dass in der Therapie weitere Fortschritte benötigt werden. Es konnte gezeigt werden, dass in vitro eine Wachstumshemmung von humanen Ovarialkarzinomzelllinien durch die Zugabe von LHRH-Analoga erreicht werden kann. Der bekannte physiologische Mechanismus der sogenannten chemischen Kastration, welcher zu einem Abfall der Gonadotropine und somit auch des Östrogen und Progesteron führt, liegt hier jedoch nicht vor. Vielmehr scheinen direkte antiproliferative Effekte über die Aktivierung von zellulären Signaltransduktionskaskaden verantwortlich zu sein. Um diese intrazellulären Mechanismen genauer zu untersuchen, sollte in der vorliegenden Arbeit ein Zellsystem etabliert werden, welche eine Ein- und Ausschaltung des LHRH-Rezeptors ermöglicht, um dann die Unterschiede der intrazellulären Vorgänge nach Zugabe von LHRH-Analoga weiter zu untersuchen. Zur Rezeptorausschaltung sollte die Synthese von induzierbarer Antisense-RNA für den LHRH-Rezeptor mittels des Ecdysoneexpressionssystems erreicht werden. In das Ecdysone-Genexpressionssystem wurde zunächst ein 626 Basenpaar großes LHRH-Rezeptorgenfragment aus dem Open-Reading-Frame des humanen LHRH-Rezeptorgens in Antisenseorientierung eingebaut. Anschliessend konnte nach Transfektion ein stabiler Einbau des Systems in die humane Ovarialkarzinomzelllinie EFO21 mit reproduzierbarem Nachweis des Antisensefragmentes in der genomischen DNA nachgewiesen werden. Eine Expression von Antisense-RNA konnte kontinuierlich nachgewiesen werden, die Antisenseorientierung wurde sowohl durch Restriktionsanalyse als auch durch eine Sequenzanalyse aus der cDNA bestätigt. Somit wurde eine neue Ovarialkarzinomzelllinie etabliert, welche, stabil transfiziert, LHRH-R-Antisense produziert. Es fand sich jedoch auch in der nichtinduzierten Zelllinie zumindest ein erhöhte basale Transkriptionsrate des Antisense-Fragmentes , so dass die Frage der Induktion des Systems durch zelleigene Substanzen oder Substanzen der Nährlösung bei Nachweis von Antisense-RNA im nichtinduzierten Zustand offen bleibt. Die Verwendung von steroid- und phenolrotfreiem Medium in den Versuchen brachte hier keine Änderung. Unklar bleibt, warum der Inducerstoff MuristeroneA etwa 1Jahr nicht zu beziehen war und hierfür der Ersatzstoff PonasteroneA verfügbar war. Im weiteren Verlauf kam der nichtsteroidale Inducer GS-E hinzu, so dass hier eine nicht ausreichend selektive Expressionsinduktion des Systems zu diskutieren ist. Veränderungen in der Wirkung des LHRH-Analogon Triptorelin auf die Proliferationshemmung der neu etablierten Ovarialkarzinomzelle OMiLe 2.1 in vitro wurden im Sinne einer reduzierten Hemmung im Vergleich zur Ausgangszelllinie nachgewiesen. Auch die Zahl der funktionsgestörten Zellen nach Triptorelinbehandlung war im Vergleich zur Ausgangszelllinie verändert. Ein Effekt der Antisense-Synthese auf das Proliferationsverhalten unter LHRH-Zugabe konnte somit gezeigt werden, jedoch nicht in dem erwarteten Ausmaß. Die Komplexizität der intrazellulären Signaltransduktionskaskade setzt ein stabiles System für die Erforschung voraus. Die nachgewiesene basale Transkriptionsrate scheint zur weiteren Analyse dieses komplexen intrazellulären Tumorsystems nicht ausreichend gering zu sein. Eine Bindung von zelleigenen Steroiden an den Ecdysonerezeptor mit Induktion des Systems in der vorliegenden Zelllinie wäre zu hypothetisieren. Die beobachteten Veränderungen der Proliferationseigenschaften der Zelllinie OMiLe 2.1 sind somit nur eingeschränkt interpretierbar und bedürften weiterführenden Untersuchungen. Die Anwendung des Ecdysonesystems bei Untersuchungen an hormonabhängigen Zelllinien (z.B. Mamma-, Endometrium-, Ovarial und Prostatazelllinien) ist aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit nicht zu empfehlen, und es sollte zur Etablierung eines Genexpressionssystemes auf andere Methoden, wie z.B. ein Metal-inducible-System als nicht steroidabhängiges System, zurückgegriffen werden.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2004.0692