Physiologische Bedeutung der alpha-Untereinheiten der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase

Die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase, die durch die Bildung von cGMP das NO-Signal in eine Erhöhung der intrazellulären cGMP-Konzentration umsetzt, besitzt eine zentrale Position innerhalb der NO/cGMP-vermittelten Signaltransduktionskaskade. Dabei kann das NO als Signalmolekül von zwei NO-Synthasen-Iso...

Ausführliche Beschreibung

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Mergia, Evanthia
Beteiligte: Klumpp, Susanne (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2003
Pharmazie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase, die durch die Bildung von cGMP das NO-Signal in eine Erhöhung der intrazellulären cGMP-Konzentration umsetzt, besitzt eine zentrale Position innerhalb der NO/cGMP-vermittelten Signaltransduktionskaskade. Dabei kann das NO als Signalmolekül von zwei NO-Synthasen-Isoformen gebildet werden, der neuronalen und der endothelialen NO-Synthase. Strukturell besteht die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase aus zwei verschiedenen Untereinheiten, a und b, und enthält eine prosthetische Häm-Gruppe, an der NO bindet. Für jede der Untereinheiten der Guanylyl-Cyclase wurden bisher durch Homologie-Klonierung zwei cDNA-Sequenzen (a1, a2 und b1, b2) isoliert, jedoch konnte auf Proteinniveau das physiologische Vorkommen von nur zwei (a1b1, a2b1) der theoretisch zu erwartenden vier Heterodimere gezeigt werden. Zwischen den a1b1- und a2b1-Heterodimeren konnten weder enzymatische noch regulatorische Unterschiede nachgewiesen werden, und so stellte sich bald die Frage nach der physiologischen Relevanz der beiden Isoformen. Eine funktionelle Differenzierung und Analyse dieser ansonsten sehr ähnlichen Isoformen (a1b1, a2b1) kann mit Hilfe von Knock-out-Mausmodellen erfolgen, in denen das a1- bzw. a2-Gen der Guanylyl-Cyclase inaktiviert ist bzw. induzierbar inaktiviert werden kann. In der vorliegenden Arbeit wurden embryonale Stammzelllinien der Maus generiert, in denen das Gen der a1- bzw. a2-Untereinheit modifiziert wurde. Dabei wurde gezielt jeweils ein wichtiges Exon mit spezifischen Erkennungssequenzen (loxP-Sequenzen) des Enzyms Cre-Rekombinase versehen. Die Erkennungssequenzen ermöglichen später in Abhängigkeit von der Expression der Cre-Rekombinase die induzierbare Deletion des Exons, so dass die Bildung einer funktionellen a-Untereinheit unterbunden wird. Die genomische Veränderung der embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) wurde durch Transfervektoren (targeting-Vektoren) erzielt, die lange genomische Sequenzen der jeweiligen a-Untereinheit enthielten, und sich deshalb an Stelle der endogenen Sequenzen in das Genom der ES-Zellen integrierten. Für die Konstruktion der targeting-Vektoren musste die genomische Organisation der a-Untereinheiten der Maus partiell analysiert, die entsprechenden genomischen Abschnitte isoliert, und diese dann mit den entsprechenden Restriktionsschnittstellen versehen und subkloniert werden. Nach Einbringen der Transfervektoren in die ES-Zellen musste die richtige Integration an der Zielposition im Genom bzw. auch die Anwesenheit der Cre-Rekombinase-Erkennungssequenzen sichergestellt werden. Hierzu wurden genomische Southern-Blots und PCR-Analysen entwickelt, die auch im weiteren für die Etablierung der Mauslinien unerlässlich sind. Aus in der vorliegenden Arbeit generierten ES-Zellen sind Mäuse entstanden, sogenannte Chimären. Diese chimären Mäuse werden zurzeit verpaart, um Nachkommen zu erzeugen, in denen das Gen der a1- bzw. a2-Untereinheit in allen Zellen modifiziert vorliegt. Durch die anschließende Verpaarung mit transgenen Cre-Rekombinase-Mäusen werden Mausmodelle generiert, in denen die jeweilige a-Untereinheit der Guanylyl-Cyclase zu ausgewählten Zeitpunkten bzw. gewebsspezifisch ausgeschaltet werden kann. In Hinblick auf die Möglichkeit einer gewebsspezifischen Inaktivierung des a1- bzw. a2-Gens sind Kenntnisse über die Gewebeverteilung der a-Untereinheiten von großer Bedeutung. Deshalb wurde im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit die relative Gewebeverteilung der Untereinheiten (a1, a2, und b1) der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase in Mausgewebe systematisch untersucht. Die relative Quantifizierung der mRNA der a1-, a2-, und b1-Untereinheit wurde mittels real-time quantitativer PCR durchgeführt. Die Lunge und das Gehirn wurden als die beiden Gewebe mit dem höchsten Guanylyl-Cyclase-Gehalt identifiziert. In der Lunge wie auch in den weiteren untersuchten peripheren Organen stellte das a1b1-Heterodimer die überwiegend exprimierte Guanylyl-Cyclase-Isoform dar, während das a2b1-Heterodimer hauptsächlich im Gehirn nachgewiesen wurde. Insbesondere wurden der Hippokampus und das Kleinhirn als die Hirnregionen mit dem höchsten a2b1-Guanylyl-Cyclase-Gehalt identifiziert, für die eine Beteiligung der NO/cGMP-Signaltransduktion an einigen Formen der synaptischen Plastizität diskutiert wird. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass die a2-Untereinheit spezifisch mit Adapterproteinen interagiert, die eine Verankerung des a2b1-Heterodimers an synaptischen Membranen vermitteln; die a1b1- und a2b1-Guanylyl-Cyclasen weisen also unterschiedliche subzelluläre Lokalisationen auf. Aufgrund der subzellulären Lokalisation und der in der vorliegenden Arbeit ermittelten Gewebeexpression der beiden Guanylyl-Cyclase-Isoformen lässt sich die Hypothese aufstellen, dass die a2b1-Guanylyl-Cyclase hauptsächlich durch das NO der neuronalen NO-Synthase stimuliert wird, während die a1b1-Guanylyl-Cyclase primär die Effekte des von der endothelialen NO-Synthase gebildeten NO weiterleitet.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2003.0114