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Titel:Komplexierung von siRNA zum spezifischen Knock Down von Luciferase in SKOV-3/Luc und 3T3 Zellen
Autor:Merkel, Olivia Monika
Erscheinungsjahr:2007
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/ed/2006/0001
URN: urn:nbn:de:hebis:04-ed2006-00015
DOI: https://doi.org/10.17192/ed.2006.0001
DDC:610 Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):Complexation of siRNA for Specific Knock Down of Luciferase in SKOV-3/Luc and 3T3 cells

Dokument

Schlagwörter:
siRNA, 3T3, Gene therapy, Luciferase, RNS-Interferenz, Co-Transfektion, Polyethylenimin, Luciferase, Transfection, siGL3, Nicht-virale Vektoren, Poly(ethylene imine), Gentherapie, PEG-PEI, SKOV-3, Gentherapie, PEI-g-PEG, Transfektion, siRNA, RNAi

Zusammenfassung:
In der vorliegenden Arbeit wurde ein Assay zur Untersuchung von PEIs als nicht-virale Vektoren für siRNA entwickelt. Hierbei diente PEI 25kDa als Kontrolle. Des Weiteren wurde PEI 5kDa (Low-Molecular-Weight-PEI „LMW-PEI“) mit geringerer Verzweigung, PEI(25k)-g-PEG(550)35 (pegyliert) mit schwächerer Komplexierung und ePEI (ethoxyliert) mit kleinerem pKa-Wert und stärkerer Protonierung im Endosom verwendet. Es wurden die Transfektionsbedingungen und das N/P-Verhältnis der Polyplexe optimiert, diese wurden außerdem physiko-chemisch charakterisiert durch Untersuchung der Komplexierung mittels Agarose-Gel-Elektrophorese und Bestimmung des hydrodynamischen Durchmessers mittels DLS. Es wurde die Effektivität der RNAi nach Transfektion einer konstitutiv Luciferase exprimierenden Zelllinie SKOV-3/Luc bzw. nach eigener Transfektion mit pDNA, die für Luciferase codiert, verglichen und mittels Chemolumineszenz-Assay quantifiziert. Die Spezifität wurde durch Messung unspezifischer Silencing-Effekte mit Kontroll-siRNA abgewandelter Sequenz überprüft, die Komplexe wurden mittels Fluoreszenz-Labelings und Konfokal-Mikroskopie lokalisiert und ihr Zerfall verfolgt.

Summary:
In this thesis, the establishment of an assay for the examination of poly(ethyleneimines) as non-viral vectors for siRNA is described. Here, branched PEI 25kDa served as a control and PEI 5kDa Low-Molecular-Weight-PEI „LMW-PEI“), less branched, PEI(25k)-g-PEG(550)35 (pegylated), which shows weaker complexation, and ePEI (ethoxylated) with a smaller pKa and stronger protonation in the endosome were tested as well. Conditions of transfection and N/P-ratios of polyplexes were optimized and polyplexes were charakterized physico-chemically by analysis of complexation in agarose gel electrophoresis and determination of hydrodynamic diameters with DLS. Knock down efficiency after transfection of a constitutively luciferase-expressing cell line SKOV-3/Luc and after self-imposed transfection with pDNA, encoding luciferase, was compared and quantified by chemoluminescence assay. Specificity was proven by detection of unspecific silencing effects with a scrambeled sequence control siRNA. Complexes were localized by fluorescence labeling and confocal laser scanning microscopy.


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