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Titel: Encapsulation of desmopressin into hydrophobic nanoparticles and hydrophilic microparticles for pulmonary drug delivery
Autor: Primaveßy, Daniel Andreas Addi
Weitere Beteiligte: Schneider, Marc (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2017
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2017/0245
DOI: https://doi.org/10.17192/z2017.0245
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2017-02456
DDC: 570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Die Einkapselung von Desmopressin in PLGA Nanopartikel und hydrophile Mikropartikel für die pulmonale Applikation

Dokument

Schlagwörter:
Nanopartikel, Nanoparticles

Summary:
Within this thesis, it was possible to set up a method of preparation that exhibits many of the desired characteristics. Up to the current point, the system includes the following possibilities: - preparation of hydrophilic microparticles of different polymers - no use of toxic substances is necessary - suitable cleaning and drying process for hydrophilic microparticles - particle stability at room temperature under air conditions for at least 11 months, depending on the formulation - encapsulation of hydrophilic compounds into hydrophobic nanoparticles - encapsulation of hydrophobic nanoparticles into hydrophilic microparticles - encapsulation of hydrophilic compounds into hydrophilic microparticles - surface modification of hydrophobic nanoparticles for targeting - preparation of porous dextran microparticles All used substances are not classified as ‘toxic’; however, at certain concentrations they are toxic to the human body. The lungs are a very sensitive organ and might react to some of these substances, even at low concentrations. Currently, there are no polymers approved for pulmonary drug delivery by EMA or FDA, but it is likely that especially biopolymers such as dextran do not show a severe impact on the lungs, if used. The organic solvents and stabilizers are more problematic. For a final formulation, they have to be minimized. For pentane, this should not be much of a problem, as it is very volatile and will not mix with the hydrophilic particles. Ethyl acetate also would not mix with the particles and should be possibly removed by freeze drying. Also, ethyl acetate is contained in, for example, wine, fruits and some kinds of nail polish. An ingestion and inhalation of smaller amounts is obviously without risk for a healthy person. Acetonitrile is more toxic than ethyl acetate, but not essential for the drying process. It has been used in this thesis, because its freezing point is at -45 °C, and it was therefore suitable for freeze drying from an organic solvent on a laboratory scale. For an industrial application, an exchange to ethanol and subsequent freeze drying would be more suitable and less toxic. The stabilizers, on the other hand, could be a major problem for pulmonary application, as they cannot be removed by freeze drying. Since they are very hydrophobic, it is not clear whether they dissolve in the alveolar lining fluid or not, but if they do, they have the potential to change its properties and affect the breathing ability. Some features of the system are only assumed and could not be proven within this thesis: - particle sizes prepared with multiple membrane cycles are suitable for lung deposition - particle sizes prepared with multiple membrane cycles are suitable for entering hair follicles These features require future work to prove or disprove them.

Zusammenfassung:
Die Dissertation besteht aus drei Elementen: der Einkapselung des Peptidwirkstoffs Desmopressin acetat in PLGA Nanopartikel (3.1), die Entwicklung einer Methode zur Herstellung von Mikropartikeln aus hydrophilen Polymeren (3.2) und der Einkapselung der PLGA Nanopartikel in eben diese hydrophilen Mikropartikel (3.3). Die PLGA Nanopartikel werden mit einer leicht modifizierten „Double Emulsion Solvent Diffusion“-Methode hergestellt. Die zentrale Änderung zu gängigen Ansätzen ist, dass vor der Emulgierung mit einer Ultraschall Sonde keine Durchmischung der beiden Phasen vorgenommen wurde und das organische Lösungsmittel nach der Herstellung durch Abzentrifugation der Partikel und Verwerfen des Überstands und nicht durch Verdampfen entfernt wurde (2.2.2). Die derart hergestellten Nanopartikel waren im Größenbereich zwischen 106 und 131 nm (hydrodynamischer Durchmesser) mit PDI < 0,1. Zetapotential und pH-Werte wurden ermittelt zwischen -38 und -44 mV und pH 5,5 und 5,9 (3.1.1). Die Beladung der Partikel wurde durch eine Doppelemulsion im ersten Schritt realisiert. Hierbei wurden unterschiedliche Stabilisatoren in der Primäremulsion getestet, um feststellen zu können, ob diese einen Einfluss auf die Einkapselung haben. Verglichen wurden alle Ergebnisse statistisch mit einer Kontrolle, in der lediglich die Oberfläche beschichtet war (keine Doppelemulsion). Es konnte hierbei gezeigt werden, dass es einen signifikanten Unterschied zwischen der Einkapselung unter Zuhilfenahme des Stabilisators Pluronic F-68 und dem Beschichtungsansatz gab. Des Weiteren war auch der Unterschied zwischen Pluronic F-68 und einer Kontrolle ohne Stabilisatoren (Doppelemulsion, aber Einkapselung ohne Stabilisator) signifikant unterschiedlich. Die beiden Kontrollen jedoch zeigten untereinander keinen signifikanten Unterschied in der Beladung, was den Schluss zulässt, dass für eine Einkapselung in die Partikel ein Stabilisator nötig ist. Die Beladungseffizienz war im besten Experiment (Pluronic F-68) hoch genug, um mit kommerziell erhältlichen Formulierungen mitzuhalten, die Einkapselungseffizienz allerdings war mit 6 bis 9% zu niedrig für eine sinnvolle Anwendung (3.1.3). Neben der quantitativen Analyse des Peptids mittels HPLC wurde auch mittels LC-MS geprüft, ob das Peptid durch die Einkapselung Schäden davonträgt, was verneint werden konnte (3.1.4). In einem weiteren Experiment wurden die PLGA Nanopartikel mit hLF-Peptid, einem Penetrationsverstärker, durch Inkubation beschichtet. Nach der Inkubation konnte gezeigt werden, dass das Peptid für mindestens 7 Tage stabil in wässriger Dispersion auf den Partikeln verbleibt. Neben der Beladung war auch eine Funktionalisierung der Partikel möglich (3.1.5). Im zweiten Teil wurde ein Transportsystem, primär für pulmonale Applikation entwickelt. Hierbei wurde besonderer Wert darauf gelegt, das System so flexibel wie möglich zu halten, um es über diese Dissertation hinaus auch für andere Anwendungen einsetzen zu können. Das erarbeitete System ist eine Abwandlung der „Emulsion Diffusion“-Methoden, anhand derer auch die PLGA Nanopartikel hergestellt wurden. Da sich die Phasen der Emulsion, die für die PLGA Nanopartikel eingesetzt wurden, aber nicht einfach vertauschen ließen, musste ein Zwischenschritt eingefügt werden, in dem die Emulsion in einem anderen Lösungsmittel als dem Präzipitationsmittel hergestellt wird (3.2). Das daraus entstehende Dreiphasensystem ist in der Lage, Partikel aus unterschiedlichen hydrophilen Polymeren (z.B.: Dextran, Chitosan, Alginat, Gelatine, Glucomannan und Lignin) herzustellen (3.2.3). Die Größen der Partikel, die mit dieser Methode hergestellt werden, lassen sich über die Größe der Emulsionstropfen steuern. Um möglichst homogene Emulsionen herzustellen, wurde eine Membranemulgierung eingesetzt, bei der die zu dispergierende Phase mehrfach eine Membran passierte und damit entsprechend der Porengröße der Membran in kleine Tropfen dispergiert wurde. Hierbei konnten Partikel aus Chitosan im Größenbereich um 500-600 nm hergestellt werden (3.2.1). Zur Vereinfachung und um schneller arbeiten zu können, wurde für einige Experimente die Emulsion mit einem Hochdruckhomogenisator hergestellt, oder es wurde bei der Membranemulgierung auf multiple Membranpassagen verzichtet. Neben der Herstellung wurde auch eine Trocknungsmethode entwickelt. Hierfür wurden die Partikel zunächst mit organischem Lösungsmittel von überschüssigem Stabilisator befreit und dann mit flüssigem Stickstoff in organischem Lösungsmittel eingefroren und daraus gefriergetrocknet (2.2.3). Derart getrocknete Partikel wiesen eine Lagerstabilität (in mit Luft gefüllten abgeschlossenen Gefäßen) von mindestens 11 Monaten auf. Einzig die Dextran Partikel wiesen nach 11 Monaten eine glattere Oberfläche auf, was auf ein Anlösen der Oberfläche in der Luftfeuchtigkeit hindeutet (3.2.3). Auch die direkte Einkapselung von Desmopressin in Dextranpartikel mittels dieser Methoden wurde getestet und führte zu deutlich höheren Einkapselungseffizienzen als bei PLGA Nanopartikeln (3.2.4). In einem weiteren Experiment wurde die Dextranlösung vor der Emulgierung mit Pluronic F-127 gemischt. Diese Mischung führte zu einer Phasentrennung zweier wässriger Phasen. Dieser Effekt konnte genutzt werden, um poröse Partikel herzustellen, indem beide Phasen vor der Emulgierung gut durchmischt wurden und dann gemeinsam emulgiert und präzipitiert wurden. Die daraus entstehenden Partikel bestanden aus zwei festen Phasen, von denen eine durch ein organisches Lösungsmittel ausgewaschen werden konnte. Die resultierenden Partikel hatten Löcher und waren porös (3.2.2). Im dritten Teil wurden dann erneut PLGA Nanopartikel hergestellt aus einem Fluoresceinamin-gelabelten PLGA. Diese Nanopartikel wurden in Dextranpartikel eingekapselt und mittels Konfokalmikroskopie untersucht. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass sich PLGA Nanopartikel in Dextranpartikel einkapseln lassen (3.3). Ein flexibles hydrophiles Trägersystem zum Transport beladener und funktionalisierter hydrophober Nanopartikel konnte erfolgreich hergestellt werden.


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