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Titel: Regulation des anaeroben Abbaus aromatischer Kohlenwasserstoffe in Aromatoleum aromaticum EbN1
Autor: Muhr, Enrico
Weitere Beteiligte: Heider, Johann (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2016
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0806
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0806
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-08065
DDC: 570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Regulation of anaerobic hydrocarbon degradation in Aromatoleum aromaticum EbN1

Dokument

Schlagwörter:
Mikrobiologie, Regulation, Kohlenwasserstoffe, Bioreporter, Zweikomponentensysteme, Micobiology, Regulation, Two-component sytem, hydrocarbon

Zusammenfassung:
Das genomsequenzierte β-Proteobakterium Aromatoleum aromaticum Stamm EbN1 und einige verwandte Arten weisen die ungewöhnliche Stoffwechselaktivität des anaeroben Abbaus von Kohlenwasserstoffen sowie phenolischen Verbindungen auf. Hierfür besitzt A. aromaticum mehrere sehr substratspezifische Stoffwechselwege. Trotz der starken chemischen Ähnlichkeit einiger Verbindungen, erfolgt die spezifische Induktion der katabolischen Enzyme ausschließlich in Anwesenheit des jeweiligen Substrates und nicht durch chemisch analoge Verbindungen. Mittelpunkt dieses Promotionsprojektes war der Mechanismus der spezifischen Sensierung von Kohlenwasserstoffen und phenolischen Substraten, sowie die Regulation der Induktion der jeweiligen Abbauwege. Durch die Kombination aus neu entwickelten und bereits etablierten biochemischen und molekularbiologischen Methoden, wurde eindeutig gezeigt, dass Ethylbenzol und p-Ethylphenol, trotz ihrer starken chemischen Ähnlichkeit, durch zwei vollständig getrennte Abbauwege mit spezifisch induzierten Enzymen metabolisiert werden. Hierfür wurden Kulturen des Stammes EbN1 unter denitrifizierenden Bedingungen neben Ethylbenzol und p-Ethylphenol auch auf Acetophenon, einem wichtigen Zwischenprodukt des anaeroben Ethylbenzolstoffwechsels, kultiviert. Die Messung der Aktivitäten aller beteiligten Enzyme, der Häm-Färbungen sowie der Immun- und Biotin-Blot-Analysen ermöglichten die Identifizierung und Differenzierung der Enzyme der beiden anaeroben Abbauwege. Weiterhin wurden Lücken des postulierten p-Ethylphenolabbauweges durch neu identifizierte Enzyme geschlossen. Zu den identifizierten Enzymen gehörte unter anderem eine Biotin-abhängige p-Hydroxyacetophenon-Carboxylase. Das aromatische Keton Acetophenon, Intermediat des anaeroben Ethylbenzolabbaus, kann durch A. aromaticum sowohl unter anaeroben als auch aeroben Bedingungen über eine ATP-abhängige Acetophenon-Carboxylase (ApcABCDE) metabolisiert werden. Um die Bedingungen genauer zu analysieren, unter denen das apc-bal Operon exprimiert ist, wurde ein Reporterstamm mit einem fluoreszierenden mCherry-Protein konstruiert. Dieser bildete die Grundlage für die Entwicklung eines spezifischen Acetophenon Bioreportersystems. Zu diesem Zweck, wurde eine Fusion des mCherry Gens mit dem ersten Gen des Operons (apcA) erstellt und in das Chromosom von A. aromaticum integriert. Die Expression dieses Fusionsproteins sowie dessen Fluoreszenzaktivität entsprach dem Expressionsmuster der Enzyme des Acetophenonmetabolismus. Zum anderen wurde nachgewiesen, dass die zugesetzte Acetophenonkonzentration, in einem Bereich von 25 bis 250 μM, proportional zur produzierten Menge an ApcA-mCherry war. Mit Ausnahme der beiden 1-Phenylethanol Enantiomere, welche von A. aromaticum leicht zu Acetophenon umgesetzt werden können, zeigten alle getesteten chemisch analogen Verbindungen keine oder deutlich schwächere Signale. Ein weiterer Teil dieser Dissertation betraf die Analyse des adiRS Operons, das für ein Zweikomponenten-Regulationssystem (TCS) kodiert, welches wahrscheinlich die Acetophenon-abhängige Induktion des apc-bal Operons in A. aromaticum reguliert. Hierfür wurde durch homologe Rekombination eine Chloramphenicol-resistente Mutante konstruiert, bei der die adiRS Gene deletiert wurden. Entgegen den Erwartungen wuchs die adiRS Deletionsmutante noch immer mit Acetophenon und Ethylbenzol. Allerdings wurden reduzierte Acetophenon-Carboxylase-Aktivitäten in Extrakten dieser Kulturen nachgewiesen. Überraschenderweise zeigte die Mutante zudem ungewöhnliche Induktionsmuster der EbDH und zwei paraloger Biotin-Carboxyl-Carrier-Proteine (XccB und XccB2), welche in Acetophenon- bzw. Ethylbenzol-abbauenden Zellen des Wildtyp-Stammes nicht induziert sind. Die Komplementation der adiRS Gene auf einem Plasmid führte nur zu einem teilweisen Ausgleich der beobachteten Abweichungen und nicht zum Phänotyp des Wildtyps. Weiterhin wurde das bereits beschriebene apcA-mCherry Reporterkonstrukt in das Chromosom der Deletionsmutante integriert. Die ermittelten Ergebnisse gaben Indizien für eine zeitverzögerte und verminderte Expression der apcA-mCherry Fusion, wenn die adiRS Gene deletiert waren. Die erhaltenen Daten sind konsistent mit der Annahme, dass die Acetophenon-abhängige Induktion des apc-bal Operons neben dem AdiRS-System möglicherweise durch ein zweites parallel wirkendes TCS beeinflusst wird. Ein möglicher Kandidat sind die xdiRS Genprodukte, welche hohe Ähnlichkeit zu AdiRS aufweisen. Abschließend wird ein vorläufiges Modell zur potentiellen Rolle der beiden TCS AdiRS und XdiRS in der Substraterkennung und -unterscheidung in A. aromaticum Stamm EbN1 vorgestellt. Schließlich wurden in dieser Arbeit mit Hilfe von Primer-Extension-Analysen erstmals putative Transkriptionsstartpunkte für die am anaeroben Ethylbenzol- und Acetophenonabbau beteiligten Operons experimentell ermittelt. Den identifizierten Startpunkten, wurden durch den Vergleich mit Konsensussequenzen σ70-abhängiger Promotoren putative -35 und -10 Regionen zugeordnet. Im Falle des apc-bal Operons könnten der umfangreiche 5‘-untranslatierte Bereich und die vorhergesagte Sekundärstruktur mit einer berechneten minimalen freien Energie von -61,4 kcal mol-1 ein Indiz dafür sein, dass diese RNA-Struktur an der transkriptionellen oder translationellen Regulation beteiligt ist.

Summary:
The genome-sequenced Aromatoleum aromaticum strain EbN1 and several related β-proteobacterial genera have the unusual metabolic capability of degrading aromatic hydrocarbons as well as phenolic compounds under anaerobic conditions. A. aromaticum possesses numerous highly substrate-specific metabolic pathways which are activated only in the presence of the respective substrate and not by chemically analogous compounds that leads to the induction of highly specific and interesting catabolic enzymes. Focus of this PhD Thesis was the investigation of the mechanism of specific sensing of hydrocarbons and phenolic substrates as well as the metabolic regulation of induction of the respective Degradation pathways. By the combination of newly developed and already established biochemical and molecular biological methods, it was possible to show that, despite having a very similar chemical structure, ethylbenzene and p-ethylphenol were metabolized by completely separate pathways with specifically induced enzymes. Therefore, cultures of strain EbN1 were grown under denitrifying conditions on ethylbenzene, p-ethylphenol and acetophenone as important intermediate in the anaerobic ethylbenzene metabolism. The results of all determined Enzyme activities, heme-staining as well as immuno- and biotin-blotting analyses allowed the identification and differentiation of the key enzymes involved in both anaerobic Degradation pathways. Additionally, the proposed p-ethylphenol degradation pathway was substantiated by newly identified enzymes including a novel biotin-dependent p-hydroxyacetophenone carboxylase. The aromatic ketone acetophenone, an intermediate of anaerobic ethylbenzene degradation, is metabolized by A. aromaticum either anaerobically or aerobically by an ATP-dependent acetophenone carboxylase (ApcABCDE). A mCherry reporter strain was constructed to study the conditions under which the genes encoding the carboxylase were expressed. This Reporter strain provides a basis for the development of a specific acetophenone bioreporter system. For this purpose, a gene fusion of the mCherry gene and the first gene of the apc-bal operon (apcA)was created and integrated into the chromosome of A. aromaticum. It could be shown that the induction of the fusion protein and its fluorescence activity responded consistently with the expression pattern of the acetophenone-metabolic enzymes. Furthermore, the recorded amounts of ApcA-mCherry production were proportional to the applied acetophenone concentrations within a range of 25 to 250 μM. With the exception of both 1-phenylethanol enantiomers which are easily converted to acetophenone by A. aromaticum, all further tested analogous compounds showed a significantly weaker signal response or none at all. Furthermore, this thesis investigates the adiRS operon encoding a two-component regulatory system which was proposed to regulate the acetophenone-dependent induction of the apc-bal operon in A. aromaticum. Therefore, a chloramphenicol resistant deletion mutant lacking the adiRS operon was constructed by homologous recombination. In contrast to the expectations, the adiRS gene deletion strain still grew on acetophenone and ethylbenzene. However, reduced acetophenone carboxylase activities were detectable in extracts of these cultures. Surprisingly, the mutant strain showed uncommon induction of EbDH and two paralogous biotin-containing carrier proteins (XccB and XccB2) which are not induced in the wildtype strain grown on acetophenone or ethylbenzene, respectively. Restoring the adiRS genes in trans only resulted in a partial reversal of the observed deviations. Moreover, a mCherry reporter strain lacking the adiRS operon was constructed as described above. The results indicated a probable timedelayed and decreased expression of the apcA-mCherry gene fusion in the reporter strain lacking the genes encoding AdiRS. The obtained data led to the assumption, that acetophenonedependent induction of the apc-bal operon is possibly mediated by a second two-component regulatory system (XdiRS) closely related to AdiRS. Finally, this study presents a tentative model of the potential role of the AdiRS and XdiRS regulatory systems in substrate recognition and discrimination in A. aromaticum strain EbN1. Finally, it was possible to map putative transcription start sites of the catabolic operons involved in the anaerobic ethylbenzene and acetophenone degradation by using primer extension Analysis for the first time experimentally. Upstream of all determined starting points putative -35 and -10 boxes could be identified by comparison with consensus sequences of σ70-dependent promoters. In case of the apc-bal operon an extensive 5’-untranslated region and the predicted secondary structure with a calculated minimum free energy of -61.4 kcal mol-1 could indicate that this RNA structure has an influence on transcriptional or translational regulation.


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