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Titel: Die osmotische Schutzsubstanz Prolin: Regulation der Prolinbiosynthese und Bildung eines osmoadaptiven Prolin-Bypass-Weges durch die evolutionäre Anpassung des Argininanabolismus
Autor: Stecker, Daniela
Weitere Beteiligte: Bremer, Erhard (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2016
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0804
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0804
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-08047
DDC: no keine Angabe
Titel(trans.): The osmostress protectant proline: regulation of the proline biosynthesis and building of an osmoadaptive proline bypass route via the evolutionary adaptation of the arginine metabolism

Dokument

Schlagwörter:
Prolin, Kompatibles Solut, Osmostress, proline, compatible solute, osmostress

Zusammenfassung:
Das Bodenbakterium B. subtilis ist in seinem Habitat starken Schwankungen hinsichtlich Osmolaritäten und Wasserhaushalt ausgesetzt. B. subtilis ist in der Lage sich an hochosmolare Wachstumsbedingungen durch die Neusynthese oder die Aufnahme der osmoprotektiven Aminosäure Prolin anzupassen. Die Prolinbiosynthese in B. subtilis kann über zwei Wege realisiert werden. Der anabole ProB-ProA-ProI-Weg wird zur Prolinproduktion für die Proteinbiosynthese genutzt. Der osmoadaptive ProJ-ProA-ProH-Weg dient der Bereitstellung großer Prolinmengen für den Einsatz als Osmostress-Schutzsubstanz. Die γ-Glutamylkinasen ProB und ProJ sind Isoenzyme, welche den jeweils ersten Schritt der beiden Prolinbiosynthesewege katalysieren. Sie unterscheiden sich maßgeblich hinsichtlich ihrer Regulation. Die Expression des proBA-Operons wird in Anpassung an die intrazelluläre Prolinkonzentration durch ein T-Box-regulatorisches System kontrolliert. Die Expression des proHJ-Genclusters steht hingegen unter osmotischer Kontrolle und wird durch den Anstieg der externen Osmolarität induziert. Auf Proteinebene wird das anabole ProB-Enzym durch Prolin allosterisch Feedback-reguliert. Das osmoadaptive ProJ-Enzym unterliegt scheinbar keiner solchen posttranskriptionellen Regulation. Die Feedback-Inhibition wird durch einen 16 Aminosäuren langen flexiblen Loop im aktiven Zentrum der γ-Glutamyl-Kinase moduliert. Die γ-Glutamyl-Kinasen ProB und ProJ zeigen hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz einen signifikanten Unterschied in diesem Loop. Das durch Prolin Feedback-inhibierte Enzym ProB aus B. subtilis weißt einen negativen Glutamat-Rest an der Aminosäure-Position 142 im flexiblen Loop auf, während das ProJ-Protein einen positiv geladenen Arginin-Rest an der entsprechenden Position zeigt. Mit Hilfe bioinformatischer Analysen konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die negative Aminosäure Glutamat in Enzymen des ProB-Typs und die positive Aminosäure Arginin in Enzymen des ProJ-Typ innerhalb der Gattung Bacillus hochkonserviert sind. Auf Grundlage dieser bioinformatischen Analysen wurden B. subtilis-Mutanten konstruiert, bei denen die negative Aminosäure Glutamat im anabolen ProB gegen die positive Aminosäure Arginin (E142R) ausgetauscht wurde. Umgekehrt wurde im osmoadaptiven ProJ-Enzym Arginin gegen Glutamat ausgetauscht. Die Aminosäuresubstitution in ProB führt zu einer verminderten allosterischen Regulation des Proteins, welche mit einer erhöhten Prolinakkumulation in vivo sowie einer gesteigerten osmotischen Toleranz einhergeht. Der Austausch in ProJ führt hingegen zu einer erhöhten allosterischen Regulation und bewirkt eine verminderte Prolinakkumulation sowie eine geringere osmotische Toleranz. Die gezeigten Daten beweisen, dass die γ-Glutamyl-Kinasen ProB und ProJ aufgrund ihrer unterschiedlichen allosterischen Regulation bestens auf ihre physiologische Funktion im anabolen oder osmoadaptiven Prolinbiosyntheseweg in B. subtilis abgestimmt sind. Die anabole und die osmoadaptive Prolinbiosynthese in B. subtilis sind über das gemeinsam genutzte Enzym ProA miteinander verknüpft. Da kein paraloges Enzym existiert, führt die Deletion von ProA zu einer massiven Reduktion der Prolinbiosynthese. Die vorliegende Arbeit zeigt Suppressormutanten, die in der Lage sind über die Rekrutierung von Enzymen des Argininstoffwechsels sowohl die anabole als auch die osmoprotektive Prolinbiosynthese aufrecht zu erhalten. Zwei Klassen von Mutationen konnten identifiziert werden: Zum einen Mutationen in der Promotorregion von des argC-Operons, welches für Gene der Argininsynthese kodiert. Zum anderen Mutationen im Regulatorprotein AhrC, welches als Repressor für die Transkription des argC-Operons fungiert. Beide Klassen von Mutationen führen zu einer verschlechterten Bindung des Transkriptionsrepressors AhrC an seine Operatorregion im Promotorbereich des argC-Operons und folglich zu einer erhöhten Expression des argC-Operons und zu größeren Ornithin-Pools in der Zelle. B. subtilis ist dazu in der Lage ausgehend von Ornithin mittels RocD, einem Enzym des Arginin-Katabolismus, dasselbe Produkt wie ProA zu bilden und kann folglich dessen Fehlen ersetzen. Desweiteren liefert die vorliegende Arbeit erste Hinweise darauf, dass die Aminosäure Arginin unter bestimmten Voraussetzungen ebenfalls als osmotische Schutzsubstanz von B. subtilis genutzt werden kann. Die gezeigten Untersuchungen demonstrieren die Fähigkeit von Bakterien sich flexibel an Beeinträchtigungen essentieller Stoffwechselwege anzupassen.

Summary:
B. subtilis lives in the upper layers of the soil and must therefore adapt to strong variations of osmolarity and water content. The soil bacterium can adapt to high osmolarity growth conditions through the osmotically induced de novo synthesis or the uptake of the compatible solute and osmostress protectant proline. B. subtilis possesses interlinked pathways for the synthesis of proline. The anabolic ProB-ProA-ProI route provides proline for protein biosynthesis, whereas the ProJ-ProA-ProH route is responsible for the high-level production of proline as an osmostress protectant. The first step of both pathways is catalyzed by the γ-glutamyl kinases ProB and ProJ. These isoenzymes show essential differences regarding their regulation. The transcription of the proBA operon is controlled in response to intracellular proline levels via a T-box regulatory element, whereas the transcription of the proHJ gene cluster is up-regulated in response to increases in the external osmolarity. ProB is feedback regulated by proline, but such a post-transcriptional regulation is unlikely to control the enzyme activity of ProJ. The enzyme-inhibitor-interaction is modulated by a flexible 16-residue loop in the active center of the γ-glutamyl kinase. ProB and ProJ from B. subtilis reveal a striking difference regarding the amino acid sequence of this loop. The feedback inhibited ProB enzyme possesses a negative glutamate residue at position 142 in the flexible loop, whereas the ProJ enzyme possesses a positively charged Arg residue at the corresponding region. Bioinformatic analysis revealed that the negative amino acid glutamate in enzymes of the ProB type and the positive amino acid arginine in enzymes of the ProJ type is highly conserved within the genus Bacillus. Based on these bioinformatic analysis we created B. subtilis mutants with a substitution of the negatively charged amino acid glutamate of the anabolic ProB enzyme against a positively charged amino acid arginine by site directed mutagenesis. Vice versa, we replaced arginine in the osmoadaptive ProJ enzyme by glutamate. The amino acid substitution in ProB caused a decreased allosteric regulation of the protein and led to an increase in the cellular proline pool and the osmotic tolerance. Conversely, the amino acid substitution in ProJ causes an increased allosteric regulation of the protein and led to a decreased proline accumulation in vivo and a reduced osmotic tolerance. Our data strongly suggest that the different allosteric controls of the ProB and ProJ are well integrated into the physiological functions of either the anabolic or osmostress adaptive proline synthesis routes of B. subtilis. The anabolic and the osmoadaptive proline pathways in B. subtilis are connected via the shared ProA protein. Because no paralogous protein to ProA exists, the deletion of the proA gene leads to a perturbation in proline biosynthesis. Suppressor mutations within the ahrC region and the argCJBD-carAB-argF region recruit enzymes of the arginine metabolism for the synthesis of proline. The suppressor mutations were of two types: First were mutations in the promoter region of argCJBD-carAB-argF, which encodes for genes of the arginine biosynthetic pathway. Second were mutations in the regulator protein AhrC, which represses the transcription of the argC operon. Both types of mutants result in a diminished binding of the transcription repressor AhrC to its operator region and enhance the transcription of the argC operon leading to increased amounts of ornithine within the cell. Ornithine can be converted via the RocD enzyme. RocD as part of the arginine degradation pathway synthesizes the same reaction product as the ProA enzyme and thereby bypassing the ProA mediated enzyme reaction. Furthermore our investigations suggest that under certain conditions the amino acid arginine can also be used as an osmostress protectant by B. subtilis. The data acquired in this dissertation demonstrate how effective bacteria can adapt to limitations on their essential biosynthetic pathways.


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