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Titel: Regulation der Autophagie durch Miz1 in Brustdrüsenzellen und embryonalen Fibroblasten
Autor: Paul, Tanja
Weitere Beteiligte: Elsässer, Hans-Peter (Prof.Dr.)
Erscheinungsjahr: 2016
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0681
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0681
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-06811
DDC: 610 Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Regulation of autophagy by Miz1 in mammary cells and embryonic fibroblasts

Dokument

Schlagwörter:
Transkriptionsfaktor, Fibroblast, Autophagie, Miz1, Brustdrüsenzellen, autophagy, mammary cells

Zusammenfassung:
Die Autophagie beschreibt einen katabolischen Prozess, bei dem für den Abbau bestimmtes Zellmaterial in Autophagosomen eingeschlossen und durch deren Verschmelzung mit Lysosomen zersetzt wird. Durch diesen Selbstreinigungs-Vorgang trägt sie zur Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase bei und hilft durch Bereitstellung von Energielieferanten bei der Anpassung an nährstoffarme Bedingungen. Neben diesen Hauptaufgaben erfüllt die Autophagie außerdem wichtige Funktionen im Rahmen der Zellreifung, Differenzierung und bei der Immunabwehr. Ein gestörter Ablauf des autophagischen Prozesses hingegen ist mit verschiedenen Krankheitsbildern assoziiert. Für eine fehlerfrei ablaufende Autophagie ist das Zusammenspiel zahlreicherer Autophagie-assoziierter Proteine notwendig, die durch verschiedene übergeordnete Systeme reguliert werden. In früheren Arbeiten konnte bereits gezeigt werden, dass der Transkriptionsfaktor Miz 1 in die Regulation der Autophagie involviert ist. Sowohl auf morphologischer als auch auf Genexpressionsebene wurden Unterschiede zwischen Zellen mit funktionierendem Miz 1 und solchen mit trunkiertem Miz 1 beobachtet. Im Rahmen dieser Arbeit sollten die gefundenen Unterschiede in einem verbesserten Zellmodell reproduziert und außerdem der Einfluss der Interaktion zwischen Miz 1 und Myc auf den autophagischen Prozess untersucht werden. Hierfür wurde zunächst die murine Brustdrüsenzellline HC11 verwendet. Nach Induktion von Autophagie durch Inkubation der Zellen mit nährstoffarmem Medium wurde zuerst der zeitliche Verlauf der Expression von Miz 1 und verschiedener anderer Gene mittels quantitativer Real Time PCR untersucht. Dabei wurde nach einer anfänglichen Hochregulierung der Expression von CDKN1a eine zeitlich versetzte Induktion von Miz 1 und Myc, zusammen mit einer Herunterregulierung von CDKN1a beobachtet. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden HC11 Zellen mit verschiedenen Konstrukten infiziert, um eine Überexpression von Miz 1, Myc bzw. der Myc-Mutante V394D zu erreichen. In dieser Mutante ist eine Interaktion der beiden Transkriptionsfaktoren nicht möglich. Diese infizierten Zellen wurden dann für 6 Stunden mit EBSS behandelt und anschließend immunozytochemisch analysiert. Zur Beurteilung der autophagischen Aktivität wurden LC 3-Färbungen quantifiziert. In Zellen, die Miz 1 überexprimierten, konnte in diesem Experiment eine leicht erhöhte autophagische Aktivität im Vergleich zur entsprechenden Kontrolle beobachtet werden. Während die Myc-überexprimierenden Zellen durch einen verstärkten Ablauf des autophagischen Prozesses auffielen, unterschieden sich Zellen die das mutierte Myc-Gen trugen kaum von den entsprechenden Kontrollzellen. Diese zuletzt genannten Ergebnisse konnten mittels Elektronenmikroskopie reproduziert werden und sprechen dafür, dass die Interaktion zwischen den beiden Transkriptionsfaktoren für die Regulierung der Autophagie eine Rolle spielt. Auch auf Genexpressionsebene konnten Unterschiede zwischen den beiden Zelllinien nach Induktion der Autophagie gezeigt werden. Zellen, die MycV394D überexprimierten, zeichneten sich im Vergleich zu Zellen, die mit dem regulären, nicht mutiertem Myc-Vektor infiziert waren, durch eine signifikant erhöhte Expression von Atg 5, Atg 12 und Spast aus. Auch einige andere Gene zeigten unterschiedliche Expressionstendenzen nach Stimulierung der Autophagie in Abhängigkeit von den beiden Konstrukten. Der Versuch einer Herunterregulierung von Miz 1 mittels sh-RNA Interferenz war leider nicht erfolgreich. Aus diesem Grund wurde ein weiteres Zellmodell etabliert, in dem ein POZ-Domäne-Knockout des Miz 1-Gens mit Hilfe des Östrogen-Rezeptor-Modulators Tamoxifen induziert werden kann. In diesen modifizierten embryonalen Mausfibroblasten wurde im Einklang mit Ergebnissen aus früheren Arbeiten beobachtet, dass ein Fehlen von Miz 1 die Anpassung an nährstoffarme Bedingungen erschwert. Im Unterschied zu den früheren Experimenten, wurden in diesen Zellen jedoch keine Genexpressionsunterschiede für Atg 4c, Atg 5 und Atg 7 in Abhängigkeit von Miz 1 gemessen. Zusätzlich wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Zelllinie entwickelt, die GFP-markiertes LC 3 bzw. einen entsprechenden Kontrollvektor überexprimieren und zukünftig zum Beispiel für Echtzeituntersuchungen der Autophagie in Abhängigkeit von Miz 1 verwendet werden können. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit nicht nur der Einfluss von Miz 1 auf die Autophagie bestätigt werden, sondern zusätzlich die Relevanz einer funktionierenden Interaktion zwischen den Transkriptionsfaktoren Miz 1 und Myc für diesen essentiellen Prozess aufgezeigt werden.

Summary:
Autophagy is a catabolic process in which cellular content determined for degradation is engulfed by autophagosomes and finally degraded by their fusion with lysosomes. With this self-cleaning mechanism it contributes to the maintainence of the cellular homeostasis and helps with the adaptation to nutrient-poor conditions by obtaining energy from intracellular resources. In addition to these main functions, autophagy fulfills important functions in the context of cell maturation, differentiation and for the immune system. Aside from that, an impaired autophagic process is associated with different disorders. The correct functioning of autophagy requires interaction of numerous autophagy-associated proteins which are tightly regulated. In previous works, it was already shown that the transcription factor Miz 1 is involved in the regulation of autophagy. Both morphological and gene expression level differences were observed between cells with wildtype Miz 1 and cells with truncated Miz 1. The aim of this thesis was to reproduce these previously found differences in an improved cell culture model and furthermore to analyze the influence of the interaction between Miz 1 and Myc on the autophagic process. For that purpose, the murine mammary cell line HC11 was used. Firstly, the change of gene expression levels from Miz 1 and other genes were analyzed over time when cells were incubated with nutrient-low medium. After an initial upregulation of CDKN1a expression, Miz 1 and Myc levels increased as CDKN1a went down again. In the further course of this work, HC11 cells were infected with different constructs aiming to overexpress Miz 1, Myc and the Myc-mutant V394D. This mutation makes Myc interaction with Miz1 not possible. These infected cells were treated with EBSS for 6 hours and subsequently immunocytochemically analyzed. Cells overexpressing Miz 1 showed a slightly increased autophagic activity, as quantified by LC 3 immunofluorescence, compared to the corresponding control. While cells overexpressing Myc showed a boosted autophagy, cells with the mutated Myc-sequence did not differ from control cells. The latter results could be reproduced with electron microscopy and are indicative for a role of the interaction between Miz 1 and Myc in the regulation of the autophagic process. Also, differences in gene expression levels between the two cell lines could be assessed after induction of autophagy. Cells that overexpressed MycV394D were characterized by a significantly induced mRNA expression of Atg 5, Atg 12 and Spast compared to cells overexpressing the non mutated Myc gene. Some additional genes showed different expression tendencies between the two constructs. A knockdown of Miz 1 via interference shRNA was unfortunately not successful. For that reason, another cell model was established in which the exons that code for the POZ-domain of Miz 1 are excised by the Cre-ER recombinase after tamoxifen induction. In accordance with previous results, deletion of Miz 1 led to a decreased adaptation ability to a nutrient-low environment in these modified mouse embryonic fibroblasts. In contrast to previous experiments, no Miz 1-dependent expression differences in Atg 4c, Atg 5 and Atg 7 were observed. Furthermore, other cell lines overexpressing GFP-labeled LC 3 and a corresponding control vector, were developed. These can be used for real time investigation of the autophagic process. Summarizing, this work not only confirmed previous results on the influence of Miz 1 on autophagy but additionally demonstrated the relevance of the interaction between Miz 1 and Myc in this essential process.


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