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Titel: Design, Synthese und Evaluation von Inhibitoren der bakteriellen RNase P und der Dengue-Virus-Protease
Autor: Ehlert, Fabian Gert Robert
Weitere Beteiligte: Diederich, Wibke E. (Prof. Dr)
Erscheinungsjahr: 2016
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0674
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0674
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-06746
DDC: 610 Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Design, Synthesis and Evaluation of Inhibitors of the bacterial RNase P and the Dengue Virus Protease

Dokument

Schlagwörter:
Denguefieber, RNase P, protease, detergent, Triton X-100

Zusammenfassung:
Das Auffinden neuer Targets und Wirkstoffe, um bakterielle und virale Infektionen auch in Zukunft behandeln zu können, ist ein zentraler Bestandteil der Bekämpfung von Infektionskrankheiten. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte ausgehend von einem Screeninghit, der ein Inhibitor der bakteriellen RNase P ist, eine Syntheseroute entwickelt werden, die nicht nur das Bereitstellen des Screeninghits in größeren Mengen, sondern auch eine einfache Variation der Substituenten des Screeninghits erlaubte. Mit Hilfe dieser Synthese konnten Verbindungen hergestellt werden, die besser löslich und aktiver im in vitro Assay waren und im Agar-Diffusionstest einen größeren Hemmhof als der initiale Screeninghit aufwiesen. Im zweiten Teil dieser Arbeit, der das de novo Design von Inhibitoren der Dengue-Virus-Protease zum Ziel hatte, wurden Inhibitoren der Dengue-Virus-Protease dargestellt, deren Grundstruktur sich von den bisher publizierten Inhibitoren der Dengue-Virus-Protease unterscheidet. Aufgrund einer wenig ausgeprägten SAR der synthetisierten Inhibitoren galt es zunächst, eine unspezifische Inhibition der Dengue-Virus-Protease durch die erhaltenen Inhibitoren auszuschließen. Eine spezifische Inhibition der Dengue-Virus-Protease durch die synthetisierten Inhibitoren konnte schließlich durch eine Verbesserung der Löslichkeit des Inhibitors im verwendeten Fluoreszenz-basierten Inhibitionsassay und durch Anwendung der dynamischen Lichtstreuung nachgewiesen werden. Die Verbesserung der Löslichkeit wurde durch ein Steigern des DMSO-Anteils im Assay erreicht. Der gesteigerte Anteil an DMSO im Fluoreszenz-basierten Inhibitionsassay ließ sich auch auf den verwendeten Thermal-Shift-Assay und das Soaking von Kristallen der Dengue-Virus-Protease übertragen. Sowohl im Thermal-Shift-Assay, als auch beim Soaking von DV3pro Kristallen konnte der DMSO-Anteil auf über 30% gesteigert werden. Dieser sehr hohe DMSO-Gehalt ermöglicht es, weniger potente oder schlecht lösliche Inhibitoren in hohen Konzentrationen auf eine Inhibition der Dengue-Virus-Protease zu testen und so mögliche Ausgangspunkte für ein weiteres Design von Inhibitoren zu erhalten. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde schließlich der Effekt des nicht-ionischen Detergenzes Triton X-100, welches Aggregate aufbrechen und damit unspezifische Inhibition verhindern soll, untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die bei dem Test von spezifischen Inhibitoren der Dengue-Virus-Protease beobachteten Effekte von Triton X-100 auch bei weiteren Proteasen und Assaysystemen auftreten. Zunächst konnte durch Verwenden von Pepstatin A, einem peptidischen und kompetitiven Inhibitor von Aspartylproteasen, gezeigt werden, dass Triton X-100 nicht das gesamte Assaysystem beeinflusst, da das Inhibitionsverhalten von Pepstatin A gegen die HIV-1-Protease und Endothiapepsin nicht beeinflusst wurde. Durch das Testen von strukturell unterschiedlichen Inhibitoren der HIV-1-Protease und Endothiapepsin konnte nachgewiesen werden, dass Triton X-100 bestimmte Inhibitoren beeinflusst, andere strukturell verwandte Inhibitoren aber nicht in ihrem Inhibitionsverhalten gegenüber der Protease gestört werden. Da in Screenings, in denen Inhibitoren unter Verwendung von Triton X-100 als Detergenz keine Inhibition mehr zeigen, davon ausgegangen wird, dass deren Inhibition nicht spezifisch ist, also durch Aggregate verursacht wird,118 führt der beobachtete Inhibitionsabfall der spezifischen Aspartylproteasen-Inhibitoren unter Triton X-100 zu falsch-negativen Hits in diesen Screenings. Um solche falsch-negativen Hits zu vermeiden, konnte gezeigt werden, dass alternativ in Dengue-Protease-, HIV-1-Protease- und Endothoapepsin-Assays das Detergenz CHAPS eingesetzt werden kann, da dieses Detergenz im vorliegenden Fall keine falsch-negativen Hits generiert. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit Inhibitoren durch die unterschiedlichen Methoden der medizinischen Chemie von sowohl bakteriellen als auch viralen Krankheitserregern gefunden und optimiert werden. Der DMSO-Gehalt der bei der Suche nach Inhibitoren der Dengue-Virus-Protease verwendeten Assaysysteme konnte deutlich gesteigert werden und es konnte nachgewiesen werden, dass Triton X-100 Inhibitoren beeinflussen kann und es daher nicht das optimale Detergenz für Screening-Kampagnen darstellt. Unter Berücksichtigung der in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse können Inhibitoren der RNase P und der Dengue-Virus-Protease entworfen und weiter optimiert werden und dank der Aussagen über die Verwendung Triton X-100 in Screening-Kampagnen lässt sich in Zukunft die Anzahl von potentiellen Ausgangspunkten für eine weitere Strukturoptimierung möglicherweise deutlich erhöhen.

Summary:
The discovery of new targets and drugs to treat bacterial and viral infections in the future is an integral part in fighting infectious diseases. In the first part of this thesis a synthetic route for a screening hit, an inhibitor of the bacterial RNase P, was developed, in order to provide the screening hit in larger quantities and to allow an easy variation of its substituents. This synthetic route delivered compounds with better solubility and improved activity in the in vitro assay as well as in the agar diffusion test compared to the initial screeninghit, resulting in an increased diameter of the inhibition zone. The second part of this thesis aimed at the de novo design of inhibitors of the dengue virus protease. Inhibitors of the dengue virus protease with a core structure different from what has been published so far, were synthesized. Due to a sparsely pronounced SAR of the inhibitors synthesized an unspecific inhibition of the dengue virus protease by the inhibitors had to be ruled out. By increasing the solubility of the compounds in the fluorescence-based inhibition assay and by using dynamic light scattering to detect aggregates in solution, a specific inhibition of the dengue virus protease was finally proven. The increased solubility was achieved by increasing the concentration of DMSO in the assay. The increased DMSO concentration in the fluorescence-based inhibition assay was also successfully applied to the thermal shift assay and to the soaking conditions for dengue virus protease crystals. Both in the thermal shift assay and for the soaking of the dengue virus protease crystals the DMSO percentage was increased to >30%. This very high concentration of DMSO allows to test less potent or poorly soluble compounds at higher concentrations for an inhibition of the dengue virus protease and thus can serve as a starting point for the development of new inhibitors. In the third part of this thesis the effect of the non-ionic detergent Triton X-100, which is used to break up aggregates in solution in order to prevent unspecific inhibition, was studied. It could be shown that the effects observed when using Triton X-100 together with specific inhibitors of the dengue virus protease were not limited to this protease but also occurred with different proteases and assay setups. By using Pepstatin A, a peptidic and competitive inhibitor of aspartic proteases, it could be shown that Triton X-100 does not negatively affect the assay system, as the inhibition of Pepstatin A versus HIV-1 protease and endothiapepsin was not altered. When testing structurally different inhibitors of the HIV-1 protease and endothiapepsin it could be shown that Triton X-100 influences the inhibition of both proteases by some inhibitors, while other structurally related inhibitors remained entirely unaffected, consequently resulting in false negatives. In screenings it is assumed that the inhibitor acts non-specific, via aggregation, when showing a lower inhibition when used together with Trition X-100 as detergent. Consequently, the decline of inhibition observed for specific aspartyl protease inhibitors together with Trition X-100 as a detergent would lead to false negative results. In order to avoid false negative results it could be shown that CHAPS as a detergent in dengue virus protease, HIV-1 protease and endothiapepsin inhibition assays did not produce false-negative hits. In summary, by applying different medicinal chemistry methods, the detection and an optimization of inhibitors of bacterial and viral targets could be achieved. The DMSO concentration used in the assay systems when screening for inhibitors of the dengue virus protease was increased and it was shown, that Triton X-100 influences specific inhibitors of different proteases, leading to false-negatives and thus being not the optimal detergent for screening campaigns. Taking into account the results of this thesis, inhibitors of the bacterial RNase P and the dengue virus protease can be designed and further optimized and due to the results of the Triton X-100 studies the hit rate of screening campaigns can eventually be increased, leading to more starting points for further hit optimization processes.


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