Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg

Titel: Sweets for my sweet - carbohydrate transport and its regulation in Sulfolobus acidocaldarius
Autor: Wagner, Michaela
Weitere Beteiligte: Albers, Sonja-Verena (Prof. Dr. rer. nat.)
Erscheinungsjahr: 2016
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0672
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0672
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-06721
DDC: 570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Sweets for my sweet - Kohlenhydrattransport und dessen Regulierung in Sulfolobus acidocaldarius

Dokument

Schlagwörter:
Archaeen, Kohlenhydrattransport, Regulation, archaea, carbohydrate transport, regulation

Summary:
Carbohydrates are energy-providing nutrients which are utilized by organisms in all three domains of life. Sugar transport into the cell is crucial for the metabolism of these nutrient as they cannot cross the membrane by simple diffusion. The hyperthermophilic crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius can utilize different carbohydrates including L-arabinose, dextrin, D-glucose, maltose, sucrose, starch or D-xylose (Grogan, 1989; Brouns et al., 2006). However, only the ABC transporter system for maltose and maltodextrin was elucidated in S. acidocaldarius by sequence homology to the maltose transporter system of S. solfataricus. In the closely related S. solfataricus several ABC transporter systems for different carbohydrates. However, no homologues of these transporter systems are present in S. acidocaldarius and the mode of sugar transport in this organism was a mystery. In order to study the principle of sugar transport and its regulation in S. acidocaldarius, I developed a genetic tool box for this organism. The genetic system, described in this thesis, is based on the uracil auxotrophic strain MW001 constructed from the S. acidocaldarius DSM639 wild type strain. Multiple markerless gene deletions, in genome tagging, ectopic integrations, complementations in cis and in trans as well as inducible homologues expression can be done by this system in MW001. This enables fundamental research as well as metabolic engineering of S. acidocaldarius. Using that system, the regulation of the maltose transporter in S. acidocaldarius was analysed first. Transcription of the maltose gene cluster was upregulated in the presence of maltose or maltodextrin indicating a regulatory mechanism. The transcriptional regulator MalR was identified among the maltose gene cluster. Characterization of the deletion mutant ΔmalR confirmed the regulatory function of this protein which acts as an activator for transcription of the mal regulon. MalR was the first identified positive regulator involved in sugar transport in the domain of Archaea. Point mutations in MalR indicated that sugar binding to MalR as well as the phosphorylation state of MalR influences its activity, but however, the elucidation of the complete regulatory mechanism in that system is still in progress. Because of the absence of other sugar related archaeal ABC transporters in S. acidocaldarius, transport mechanism for other carbohydrates were not known for long time. However, we could identify an ABC transporter system responsible for D-xylose and L-arabinose uptake. Transcription of the transporter operon was induced in the presence xylose or arabinose. Deletion mutants of the arabinose/xylose sugar transporter units confirmed the function of the transporter which is relevant if only low carbohydrate concentrations are present. However, evidence for a second D-xylose/L-arabinose transporter is provided by growth of the mutants in the presence of higher sugar concentrations. D-xylose and L-arabinose activated not only transcription of the ABC transporter operon, but also induced transcription of two genes involved in the aldolase independent pentose degradation. Deletion of these metabolizing enzymes α-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase (KGSADH) and 2-keto-3-deoxyarabinoate/xylonate dehydratase (KDXD/KDAD) indicated the probable absence of the aldolase dependent pentose degradation pathway from S. acidocaldarius. Taken together, the work presented in this thesis give first and new insights into carbohydrate transport and it regulation in S. acidocaldarius. The knowledge about the sugar transport and metabolism together with the developed genetic tool box enables the utilization S. acidocaldarius as chassis for metabolic engineering and industrial usage.

Zusammenfassung:
Kohlenhydrate sind energieliefernde Nährstoffe, die von Organismen in allen Domänen des Lebens genutzt werden. Der Transport dieser Kohlenhydrate in die Zelle ist die entscheidende Grundlage für die Verwertung dieser Nährstoffe, weil Zuckermolekule nicht durch die Membran diffundieren können. Das hyperthermophile Crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius kann verschiedenste Zucker wie L-Arabinose, Dextrin, D-Glcuose, Maltose, Saccharaose, Stärke oder D-Xylose verwerten (Grogan, 1989; Brouns et al., 2006). Aber bisher wurde in S. acidocaldarius nur der Maltose/Maltodextrintransporter aufgrund von Sequenzhomologien zu dem identifizierten Maltosetransporter in S. solfataricus gefunden. In dem nahe verwandten S. solfataricus wurden bereits viele verschiedene ABC Zuckertransportsysteme für unterschiedliche Kohlenhydrate identifiziert. In S. acidocaldarius sind allerdings keine weiteren Homologen zu diesen Transportern gefunden worden und der Mechanismus des Zuckertransports war bis dahin ein Rätsel. Um die Mechanismen des Zuckertransports und dessen Regulierung in S. acidocaldarius untersuchen zu können, habe ich ein genetischen System für diesen Organismus entwickelt. Das hier beschriebene genetische System basiert auf den uracilauxtrophen Stamm MW001, der vom Wildtyp S. acidocaldarius DSM639 generiert wurde. Sowohl einfache als auch mehrfache Gendeletionen, Genommarkierungen, die Insertion von Fremd-DNA, Komplementierungen in cis und in trans als auch induzierbare homologe Expressionen können in MW001 angewandt werden. Dadurch wird sowohl Grundlagenforschung als auch die industrielle Nutzung von S. acidocaldarius ermöglicht. Mit Hilfe dieses genetischen Systems wurde zunächst die Regulation des Maltosetransporters in S. acidocaldarius untersucht. Die Transkription des Maltosegenclusters war in der Anwesenheit von Maltose/Maltodextrin verstärkt, was auf einen regulatorischen Mechanismus hinweist. Der Transkriptionsregulator MalR wurde innerhalb des Genclusters identifiziert. Die Charakterisierung der Deletionsmutanten ΔmalR bestätigte die regulatorische Funktion dieses Proteins, das als Aktivator der Transkription der mal Gene fungiert. MalR war der erste identifizierte archaeale Aktivator, der in Zuckertransport involviert ist. Punktmutationen in MalR deuteten darauf hin, dass sowohl Zuckerbindung als auch die Phosphorylierung von MalR dessen Aktivität beeinflussen. Aber der gesamte regulatorische Mechanismus dieses Systems muss immer noch aufgeklärt werden. Die Transportmechanismen für andere Kohlenhydrate blieb lange Zeit unbekannt, da keine Homologien zu anderen bereits identifizierten archaealen Zuckertransportern gefunden wurden. Trotzdem konnten wir den D-Xylose and L-Arabinose ABC-Transporter identifizieren. Die Transkription dieses Transporteroperons wurde durch die Anwesenheit von Xylose oder Arabinose induziert. Deletionsmutanten einzelner Transportereinheiten bestätigten die Funktion als Transporter, der im Besonderen bei geringen Zuckerkonzentrationen von Bedeutung war. Das Wachstum dieser Transportermutanten in Anwesenheit von hohen Zuckerkonzentrationen lässt allerdings auf ein zweites bisher unbekanntes Zuckertransportsystem schließen. D-Xylose und L-Arabinose aktivieren nicht nur die Transkription des ABC Transporters sondern auch die von zwei andere Genen. Diese beiden Gene kodieren die Enzyme α-Ketoglutaratesemialdehyddehydrogenase (KGSADH) und 2-keto-3-deoxyarabinoate/xylonatedehydratase (KDXD/KDAD), welche im aldolaseunabhängigen Pentoseabbauweg involviert sind. Die Deletionen dieser beiden Enzyme deuten darauf hin, dass S. acidocaldarius ausschließlich den aldolaseunabhängigen Pentoseabbauweg benutzt. Die hier präsentierte Arbeit gibt erste und vor allen Dingen neue Einblicke in den Kohlenhydrattransport und dessen Regulierung in S. acidocaldarius. Das gewonnene Wissen über den Zuckertransport und den Metabolimus zusammen mit der Entwicklung eines genetischen Systems eröffnen die Möglichkeit S. acidodaldarius metabolisch zu verändern und für industrielle Zwecke zu nutzen.


* Das Dokument ist im Internet frei zugänglich - Hinweise zu den Nutzungsrechten