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Titel: Die Cav- und KCa/SK- Ionenkanalfamilien in Locus Coeruleus Neuronen der Maus - Funktionelle Charakterisierung und Implikationen für die Parkinson-Erkrankung
Autor: Matschke, Lina
Weitere Beteiligte: Decher, Niels (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2017
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0458
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0458
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-04585
DDC: 500 Naturwissenschaften
Titel(trans.): The Cav- und KCa/SK- ion channel families in Locus Coeruleus neurons of the mouse - Functional characterization and implications for Parkinson’s disease

Dokument

Schlagwörter:
Locus coeruleus, Parkinson-Krankheit, Calciumkanal, Kaliumkanal, calciumaktivierter Kaliumkanal, Patch Clamp, Locus Coeruleus, Parkinson´s disease, calcium channel, calcium activated potassium channel

Zusammenfassung:
Der Locus Coeruleus (LC) ist ein noradrenerger Kern des Hirnstammes, der an der Regulation vielfältiger, physiologischer Prozesse beteiligt ist. Störungen des LC-Noradrenalin Systems sind in der Pathogenese verschiedener psychiatrischer und neurodegenerativer Erkrankungen beteiligt und sind ein frühes Kennzeichen der Parkinson-Krankheit (PD). Während die Degeneration von Neuronen der Substantia Nigra pars compacta (SNpc) den motorischen Leitsymptomen der PD unterliegt, wird der ausgeprägte Verlust noradrenerger Neurone des LC für einen Großteil der nichtmotorischen Dysfunktionen dieser Erkrankung verantwortlich gemacht. Die Ursachen für die selektive Vulnerabilität der LC Neurone in der Pathogenese der PD sind bislang jedoch weitestgehend unklar. Um eine tonische Noradrenalin-Ausschüttung zu gewährleisten, verfügen LC Neurone über einen intrinsischen Schrittmachermechanismus, welcher direkt an intrazelluläre Überlebenssignalwege gekoppelt ist. So führt aktivitätsabhängiger, durch L-Typ Ca2+ Kanäle vermittelter Ca2+ Influx, zu oxidativem Stress in LC Neuronen und anderen von der PD Pathogenese betroffenen Kerngebieten. Des Weiteren wird eine neuroprotektive Rolle Ca2+ aktivierter Kaliumkanäle postuliert, welche den Schrittmachermechanismus dopaminerger SNpc Neurone modulieren. Die Identifikation von Ionenkanälen, die der elektrischen Aktivität unterliegen, kann somit zu einem besseren Verständnis der selektiven Vulnerabilität coerulärer Neurone führen. Innerhalb dieser Arbeit wurden daher mittels RT-PCR Expressionsanalysen und Patch-Clamp Messungen in akuten Hirnstammschnitten die molekulare Komposition und Funktion verschiedener Ionenkanalfamilien in LC Neuronen der Maus charakterisiert. Zunächst erstellte ich ein Profil bezüglich der elektrophysiologischen Charakteristika und der Expression kaliumselektiver Ionenkanäle coerulärer Neurone. Diese Analysen zeigten, dass der elektrophysiologische Phänotyp der LC Neurone durch regelmäßige, breite Aktionspotenziale mit einer ausgeprägten Nachhyperpolarisation, die um ein depolarisiertes Membranpotenzial fluktuieren, gekennzeichnet ist. Mittels der Expressionsanalyse konnte ich die molekulare Komposition spannungsabhängiger Kaliumkanäle aufklären, die wahrscheinlich den A-Typ K+ Strom und den persistierenden K+ Strom der LC Neurone vermitteln. Als A-Typ Kaliumkanäle wurden unter anderem Kv4.3 sowie Kv1 in Kombination mit Kvβ1 detektiert, welche durch das oxidative Potenzial der Zelle reguliert werden und deshalb unter pathologischen Bedingungen mit gestörter Funktion der Mitochondrien von Bedeutung sein könnten. Des Weiteren detektierte ich Amplifikate der GIRK Kanal Unterheinheiten GIRK-1 und GIRK-4 sowie verschiedene K2P Kanal-Untereinheiten, welche an der Aufrechterhaltung des Ruhemembranpotenzials zentraler Neurone beteiligt sind. Zur funktionellen Charakterisierung spannungsabhängiger Ca2+ Kanäle führte ich RT-PCR Expressionsanalysen sowie Patch-Clamp Messungen in Kombination mit L- und T-Typ Ca2+ Kanal Blockern durch. Diese Experimente zeigten, dass sowohl Ca2+ Kanäle der Unterfamilien Cav1 als auch Cav3 in LC Neuronen exprimiert sind und eine ausgeprägte „low voltage“ aktivierte Ca2+ Leitfähigkeit vermitteln. Die Analyse der Aktionspotenzial-Folgen ergab, dass weder die Inhibition von L- noch von T-Typ Ca2+ Kanälen allein die Feurrate oder die Aktionspotenzial-Parameter der LC Neurone verändert. Die kombinierte Applikation der Kanal-Blocker führte jedoch zu einer signifikanten Reduktion der Nachhyperpolarisation und daraus resultierend zu einer Beschleunigung der Feuerrate. Diese Ergebnisse beschreiben erstmals die funktionelle Expression von T-Typ Ca2+ Kanälen in LC Neuronen und demonstrieren ihre Rolle bei der Modulation des Schrittmachermechanismus im Zusammenspiel mit L-Typ Ca2+ Kanälen. T-Typ Ca2+ Kanäle sollten demnach neben den „low-voltage“ aktivierten L-Typ Ca2+ Kanälen als Kandidaten in Betracht gezogen werden, die aktivitätsabhängigen oxidativen Stress im Kontext pathologischer Bedingungen vermitteln könnten. Im Rahmen der funktionellen Charakterisierung Ca2+ aktivierter Kaliumkanäle detektierte ich die Expression der SK Kanal Familienmitglieder SK1, SK2 und SK3 in LC Neuronen. Mittels Patch-Clamp Messungen in Kombination mit dem selektiven SK Kanal Blocker Apamin und dem positiven SK Kanal Modulator NS309 konnte ich demonstrieren, dass SK Kanäle maßgeblich für die während der Nachhyperpolarisation fließenden K+ Auswärtsströme verantwortlich sind. Während Aufnahmen der Aktionspotenzialabfolgen bewirkte die Inhibition der SK Kanäle eine Reduktion der Nachhyperpolarisation und eine beschleunigte Feuerrate, während ihre Aktivierung zu einer Vergrößerung der Nachhyperpolarisation und einer verlangsamten Frequenz führte. SK Kanäle können demnach als wichtige Regulatoren der Schrittmacherfrequenz von LC Neuronen angesehen werden. Mittels Calcium Imaging Experimenten im in vitro Glutamat- und Rotenon-Toxizitätsmodell konnte ich darüber hinaus zeigen, dass die pharmakologische SK Kanal Aktivierung die Dysregulation der Ca2+ Homöostase unter toxischen Bedingungen verhindert. Mittels Patch-Clamp Messungen konnte ich erstmals demonstrieren, dass die akute Rotenon-Exposition eine Depolarisation und eine Steigerung der Aktionspotenzial-Frequenz in LC Neuronen induziert, welche durch die SK Kanal Aktivierung unterbunden werden konnte. Stereologische Analysen zeigten schließlich, dass die SK Kanal Aktivierung mit NS309 signifikant der Degeneration von LC Neuronen im in vitro Rotenon- Toxizitätsmodell entgegenwirkt. Die Aktivierung von SK Kanälen wird demnach als ein vielversprechender Ansatzpunkt zur Neuroprotektion des LC während früher Stadien der PD Pathogenese postuliert.

Summary:
The Locus Coeruleus (LC) is a noradrenergic nucleus of the brainstem that plays a major role in the regulation of versatile physiological processes. Dysfunction of the LC noradrenergic system is involved in psychiatric and neurodegenerative diseases and is an early hallmark of Parkinson´s disease (PD). While degeneration of dopaminergic Substantia Nigra pars compacta (SNpc) neurons accounts for the motor symptoms observed in PD patients, the extensive loss of noradrenergic LC neurons is responsible for most of the non-motor symptoms that occur in early stages of the disease. However, the reasons why LC neurons are selectively vurnerable during the pathogenesis of PD are only poorly understood. To warrant a permanent release of Noradrenaline LC neurons possess an intrinsic pacemaking mechanism, which is ultimately coupled to cell survival signaling pathways. It is suggested that activity-dependent Ca2+ Influx, mediated by L-type Ca2+ channels, leads to mitochondrial oxidant stress in LC neurons and other PD-related brain regions. In addition, a neuroprotective function of Ca2+ activated potassium channels that modulate pacemaking of dopaminergic SNpc neurons, is proposed. Therefore, the analysis of ion channels underlying the autonomous electrical activity of LC neurons can lead to a better understanding of the vulnerability of these neurons. In the present study, I performed RT-PCR expression analysis and utilized patch-clamp recordings of in vitro brainstem slices to characterize the molecular composition and function of distinct ion channel families in mouse LC neurons. First, a profile regarding the electrophysiological characteristics and the expression of potassium selective ion channels in LC neurons was compiled. These analyses revealed an electrophysiological phenotype of LC neurons that was marked by regular, broad action potentials with pronounced afterhyperpolarizations fluctuating around a depolarized membrane potential. Utilizing RT-PCR expression analyses the molecular composition of voltage dependent potassium channels that most probably mediate the A-type K+ and the persistent K+ currents of LC neurons was elucidated. Among others, the A-type channels Kv4.3 and Kv1 in combination with Kvβ1 were detected. These channels are modulated by the oxidative potential of a cell and could therefore play a role during pathological conditions where mitochondrial function is impaired. In addition, expression of the GIRK channel subunits GIRK-1 and GIRK-4 as well as distinct K2P channel subunits, that are involved in setting the resting membrane potential of central neurons, was detected. In the course of the functional characterization of voltage dependent Ca2+ channels I utilized RT-PCR expression analyses as well as slice patch clamp recordings in combination with L-type and T-type Ca2+ channel blockers. These experiments showed the expression of both Cav1 and Cav3 subtypes in LC neurons mediating a pronounced low-voltage activated Ca2+ conductance. Analyzing action potential trains, I revealed that neither L-type nor T-type Ca2+ channel antagonism alone leads to a change in firing frequency or action potential properties. However, a combined application of antagonists significantly decreased the afterhyperpolarization, resulting in an increased firing frequency. Hence, I report for the first time the functional expression of T-type Ca2+ channels in LC neurons and demonstrate their role in modulating the pacemaking mechanism of LC neurons by working in concert with L-type Ca2+ channels. Next to L-type Ca2+ channels, T-type Ca2+ channels should therefore be taken into account as potential candidates in mediating activity-dependent oxidant stress under pathological conditions. In the course of the functional characterization of Ca2+ activated potassium channels in LC neurons the expression of the SK channel subtypes SK1, SK2 and SK3 was revealed. Using slice patch clamp recordings in combination with the selective SK channel antagonist Apamin and the positve SK channel modulator NS309 I display that SK channels mediate K+ outward currents that flow during the afterhyperpolarization of LC neurons. Recordings of spike trains elucidated that inhibition of SK channels leads to decreased afterhyperpolarizations and an increased firing frequency whereas activation of these channels results in augmented afterhyperpolarizations and a decelerated firing frequency. Hence, SK channels can be considered as important regulators of LC neuron pacemaking. Using Calcium Imaging experiments in in vitro models of glutamate and rotenone toxicity I revealed that the pharmacological SK channel activation prevents a dysregulation of the intracellular Ca2+ homeostasis. Additionally, my patch clamp experiments demonstrated for the first time that acute rotenone exposure induces a significant depolarisation and an increase of firing frequency in LC neurons which could be prevented by SK channel activation. Eventually, stereological analyses showed that SK channel activation via NS309 significantly counteracts the degeneration of LC neurons induced by toxic concentrations of rotenone in vitro. Thus, the activation of SK channels is proposed as a promising target to protect LC neurons in early stages of the PD pathology.


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