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Titel: Die Bedeutung der Formine FMNL1, 2 und 3 für die Invasivität und das Wachstum von Melanomzellen in vitro und in vivo
Autor: Hauswald, Maria
Weitere Beteiligte: Czubayko, Frank (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2016
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0325
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0325
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-03250
DDC: 610 Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Role of the formins FMNL1, 2 and 3 for invasion and proliferation of melanoma cells in vitro and in vivo

Dokument

Schlagwörter:
Formine, FMNL1, FMNL2, FMNL3, Aktin, Invasivität, Proliferation, Melanom, formins, FMNLs, invasiveness, proliferation, melanoma

Zusammenfassung:
Aktinfilamente sind ein wesentlicher Bestandteil des Zytoskeletts in Eukaryonten. Für zahlreiche essentielle zelluläre Prozesse wie die Migration, die Adhäsion, den intrazel-lulären Vesikeltransport und die Zytokinese ist der zielgerichtete, rasche Auf- und Abbau von Aktinfilamenten unerlässlich. Eine wichtige Rolle bei der Assemblierung dieser Filamente spielen Aktinnukleatoren, zu denen unter anderem Formine wie FMNL1-3 zählen. Bei Tumorerkrankungen wie dem malignen Melanom stellt die Metastasierung des Primärtumors eine der Haupttodesursachen dar. Dabei ist für das Wachstum des Tu-mors und dessen Metastasen neben der Invasionsfähigkeit der Tumorzellen auch ihre Fähigkeit, an die extrazelluläre Matrix (EZM) zu binden, von entscheidender Bedeu-tung. Da diese beiden Prozesse durch das Aktinzytoskelett beeinflusst werden, ist die Untersuchung einer diesbezüglichen Formin-Abhängigkeit besonders interessant. Bisherige Untersuchungen konzentrierten sich lediglich auf den Einfluss von FMNL2 auf die Invasivität von Zellen. Daher war es Gegenstand dieser Arbeit, den Einfluss von FMNL1-3 auf die Invasivität und besonders auf das Zellwachstum in humanen Melanomzelllinien zu analysieren. Anhand von siRNA- oder shRNA-vermittelter Expressionsverminderung von FMNL1-3 in zwei invasiven Melanomzelllinien WM278 und LOX konnte gezeigt werden, dass hauptsächlich FMNL2 die Invasivität der Zellen beeinflusst. Weiterhin konnte im Rahmen dieser Arbeit in vitro eine deutliche Abhängigkeit des Adhäsions-unabhängigen Wachstums der Zellen von FMNL2 und besonders FMNL3 gezeigt werden. In Mausstudien konnten wir zudem einen Einfluss von FMNL2 und FMNL3 auf das Tumorwachstum sowie die Ausbildung von MV3- und LOX-Zell-Tumoren nachweisen. Weitere Untersuchungen dieser Zellen zeigten ein Defizit im Ablauf des Zellzyklus. Dies äußerte sich in einem beeinträchtigten Übergang von der G1- in die S-Phase, was zu einem erhöhten Zell-Anteil in der G1-Phase führte. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Anzahl fokaler Adhäsionen und somit die Interaktion zwischen Zelle und EZM durch FMNL2 und FMNL3 beeinflusst wird. Bei allen Untersuchungen war der Effekt einer kombinierten Runterregulierung von FMNL2 und FMNL3 am stärksten, was auf eine redundante Funktion dieser beiden Formine hinweist. Um starke Effekte z.B. auf die Proliferation zu erzielen, muss daher eine gewisse Schwellenkonzentration beider FMNLs unterschritten werden. Dies könnte durch die von uns nachgewiesene Hetero-Dimerisierung von FMNL2 und FMNL3 bedingt sein. Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass sowohl FMNL2, neben seiner Bedeutung für die Invasivität von Melanomzellen, als auch FMNL3 eine bedeutende Rolle für das Wachstum von Melanomzellen in vitro und in vivo spielen. Dabei führt vermutlich die reduzierte Anzahl fokaler Adhäsionen nach FMNL2- und/oder FMNL3-Runterregulierung zu einer Beeinträchtigung des Zellzyklus und somit zu einem verminderten Zellwachstum.

Summary:
Actin filaments are crucial components of the eukaryotic cytoskeleton. The rapid, specific assembly and disassembly of actin filaments is essential for various cellular processes, i.e. migration, adhesion, intracellular vesicle transport and cytokinesis. Differ-ent actin nucleators, such as the formins FMNL1-3, play a major role in regulating these processes. In many tumor diseases – such as malignant melanoma – metastasis is a main cause of death. Apart from the invasiveness of tumor cells, the capability of adhering to the extracellular matrix (ECM) is a crucial factor for tumor and metastatic growth. As both processes depend on the reorganization of the actin cytoskeleton, it is particularly interesting to investigate the role of formins in these events in human melanoma cells. Current research mainly focused on the influence of FMNL2 on cancer cell invasion. Thus, the topic of this thesis was to investigate the effect of FMNL1-3 on cancer cell invasion and furthermore on cellular proliferation. Using siRNA- and shRNA- mediated knockdown of FMNL1-3 in the two invasive melanoma cell lines WM278 and LOX, we show that mainly FMNL2 influences the invasiveness of cells. Furthermore, FMNL2 and especially FMNL3 are necessary for anchorage-independent growth in vitro. Additionally, we demonstrate in mouse studies an effect of FMNL2 and FMNL3 on tumor initiation and growth of MV3 and LOX cells. Further analysis of these cells showed a deficiency in cell cycle progression due to an impaired G1- to S-phase transition resulting in an enhanced percentage of cells in G1. Moreover we could show an influence of FMNL2 and FMNL3 on the number of focal adhesions, subsequently indicating an impaired cell-matrix interaction. In each analy-sis, a combined knockdown of FMNL2 and FMNL3 displayed the strongest effects, indicative of a redundant function of these two formins. Thus, the concentration of both proteins has to deceed a certain limit in order to obtain strong effects as a de-crease in proliferation. This is likely due to a hetero-dimerization of FMNL2 and FMNL3, which we observed in co-immunoprecipitation and IP-mass spec studies. Thus, our data show that FMNL2 and FMNL3 play important roles for the prolifera-tion of melanoma cells in vitro and in vivo, in addition to their requirement for cancer cell invasion. Presumably, the reduced amount of focal adhesions after FMNL2- and/or FMNL3 -knockdown impairs the cell cycle leading to a reduced proliferation.


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