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Titel: Analysis of Bacillus subtilis spore germination and outgrowth in high-salinity environments
Autor: Nagler, Katja
Weitere Beteiligte: Bremer, Erhard (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2017
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0226
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0226
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-02268
DDC: 570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Untersuchung der Keimung und des Auswachsens von Bacillus subtilis Sporen unter salinen Umweltbedingungen

Dokument

Schlagwörter:
Mikrobiologie, Bacillaceae, Keimung, Salzstress, Bakterien, Astrobiologie, Bodenökologie, Lebensmittelmikrobiologie, Sporen, Bacillus subtilis, Spore germination, outgrowth, salt stress, high salinity

Summary:
Upon nutrient depletion, the soil bacterium Bacillus subtilis can form highly resistant, metabolically dormant spores. Spores consist of a dehydrated core (harboring the spore genome) enveloped in an inner spore membrane, a peptidoglycan germ cell wall and cortex, an outer spore membrane, and a proteinaceous coat. When specific nutrients (‘germinants’) become available again, they can bind to germinant receptors in the inner spore membrane and induce spore revival, consisting of a germination and an outgrowth phase. During germination, spores lose their resistance, release ions and Ca2+-dipicolinate (Ca2+-DPA) from the core in exchange for water (‘core rehydration’), and hydrolyze their cortex. When core rehydration is sufficient to allow enzymatic activity, metabolism is re-activated. This hallmarks the beginning of the outgrowth phase, during which spores undergo molecular reorganization and elongate. The effects of high salt concentrations and osmotic stress on spore revival were previously poorly investigated, although this topic is relevant for basic research, food microbiology, soil ecology, and astrobiology. Therefore, in this doctoral thesis, the impact of high salinity on Bacillus spore revival was examined, primarily focusing on B. subtilis spore germination in the presence of high NaCl concentrations. In general, increasing salt concentrations exerted increasingly detrimental effects on germination, although some spores initiated germination despite very high salinities. In the presence of high NaCl concentrations (≥ 1.2 mol/L), B. subtilis spore germination was delayed, slower, more heterogeneous, and less efficient. Other salts also inhibited germination, although their inhibitory strength varied depending on ion concentrations, ionic species (and their combination), and the chemical properties of the salt. Although ionic stress was indeed an important factor, high concentrations of non-ionic osmotic solutes had similar inhibitory strengths as iso-osmotic NaCl concentrations, suggesting that osmotic stress plays a decisive role in NaCl-inhibition. Strikingly, spores having strong coat defects showed exacerbated inhibition by NaCl but not by non-ionic solutes, indicating an important role of the spore coat (possibly in combination with the outer spore membrane) in protecting the subjacent inner spore structures (i.e. cortex, germ cell wall, germination apparatus, and inner spore membrane) from ionic stress. Based on these findings, a first mechanistic model for germination inhibition by high salinity is proposed. In this model, ionic interactions with the germinant and/or spore coat slow germinant passage to the germinant receptors, thereby delaying germination initiation. Subsequently, osmotic inhibition of core rehydration and concomitant Ca2+-DPA release slows germination after its initiation. While metabolic reactivation was observable at up to 4.8 mol/L NaCl, successful outgrowth in terms of elongation was observable at up to 2.4 mol/L NaCl, but only under nutrient-rich conditions. Transcriptomic analyses of salt-stressed outgrowing spores indicated many similarities to vegetative cells exposed to sustained high salinity, including the induction of B. subtilis’ complete genetic repertoire of osmoprotectant uptake and compatible solute synthesis. Taken together, this doctoral thesis yielded the first mechanistic model for inhibitory high-salinity effects on B. subtilis spore germination as well as the first comprehensive transcriptomics study of the salt stress response of outgrowing B. subtilis spores. These results contribute to the basic understanding of the influence of salt on B. subtilis’ life cycle, and are valuable for the aforementioned applied research fields as well.

Zusammenfassung:
In Folge von Nährstoffverknappung kann das Bodenbakterium Bacillus subtilis resistente, metabolisch inaktive Sporen bilden. Diese Sporen bestehen aus einem dehydrierten Sporenkern der das Sporengenom enthält, umschlossen von einer inneren Sporenmembran, einer Keimzellwand und einem Cortex aus Peptidoglycan, einer äußeren Sporenmembran und einer mehrlagigen Protein-Schicht (‚Coat‘). Wenn bestimmte Nährstoffe (‚Keimungsinduktoren‘) verfügbar werden, können sie an Keimungsrezeptoren in der inneren Sporenmembran binden. Dies induziert die Spore-Reaktivierung, welche sich aus einer Keimungsphase und einer Auswachsphase (‚Outgrowth‘) zusammensetzt. Während der Keimung verlieren Sporen ihre Resistenzen, ersetzen die Ionen und das Ca2+-Dipicolinat (Ca2+-DPA) des Sporenkerns mit Wasser (Kern-Rehydrierung) und hydrolysieren ihren Cortex. Wenn der Wassergehalt des Kerns hoch genug für Enzymaktivitäten ist, wird der Metabolismus reaktiviert. Dies kennzeichnet den Beginn der Auswachsphase, während welcher sich die gekeimten Sporen molekular reorganisieren und ihr Elongationswachstum beginnt. Wie sich hohe Salzkonzentrationen und osmotischer Stress auf die Sporen-Reaktivierung auswirken war bisher kaum erforscht, obwohl dieses Themengebiet für Grundlagenforschung, Lebensmittelmikrobiologie, Bodenökologie und Astrobiologie relevant ist. Daher wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit die Auswirkungen von Salzstress auf die Bacillus Sporen-Reaktivierung mit Hauptaugenmerk auf die Keimung von B. subtilis in Gegenwart hoher NaCl Konzentrationen untersucht. Im Allgemeinen wirkten sich steigende Salzkonzentrationen zunehmend negativ auf die Keimung aus, obwohl ein Teil der Sporen trotz hoher Salinität die Keimung initiierte. In der Gegenwart von hohen NaCl Konzentrationen (≥ 1.2 mol/L) keimten B. subtilis Sporen verspätet, langsamer, heterogener und ineffizienter. Auch andere Salze inhibierten die Keimung, doch ihre inhibitorische Stärke variierte stark in Abhängigkeit von der jeweiligen Ionenkonzentration, der Art und Kombination der Ionen und den chemischen Eigenschaften des Salzes. Obwohl dies unterstreicht, dass ionischer Stress eine Rolle in der Inhibition spielt, hatten hohe Konzentrationen nicht-ionischer, osmotisch wirksamer Solute eine ähnlich inhibitorische Wirkung wie NaCl-Lösungen mit äquivalenter Osmolarität. Somit ist osmotischer Stress eine wesentliche Determinante der Keimungsinhibition durch NaCl. Interessanterweise keimten Sporen mit Coat-Defekten in der Gegenwart von NaCl noch wesentlich schlechter als intakte Sporen, nicht jedoch in der Gegenwart nicht-ionischer Solute. Dies legt nahe, dass der Coat (möglicherweise zusammen mit der äußeren Sporenmembran) eine wichtige Funktion zum Schutz der unterliegenden Sporenstrukturen (d.h. Cortex, Keimzellwand, Keimungsapparat und innere Sporenmembran) vor ionischem Stress besitzt. Basierend auf diesen Beobachtungen wurde im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit das erste mechanistische Modell zur Keimungsinhibition durch Salzstress erarbeitet. Laut diesem Modell erschweren ionische Interaktionen mit dem Keimungsinduktor und/oder dem Coat die Diffusion des Induktors zu den Rezeptoren in der inneren Sporenmembran, so dass die Keimung verspätet ausgelöst wird. Im Anschluss behindert osmotischer Stress die Kern-Rehydrierung und den damit verknüpften Ca2+-DPA Efflux, was den Gesamtprozess der Keimung verlangsamt. Obwohl eine metabolische Reaktivierung von Sporen selbst in der Gegenwart von 4.8 mol/L NaCl noch messbar war, konnte Outgrowth im Sinne von Elongation bis zu einer NaCl Konzentration von 2.4 mol/L in nährstoffreichem Medium beobachtet werden. Eine Transkriptom-Analyse Salz-gestresster, auswachsender Sporen zeigte viele Ähnlichkeiten zur Stress-Antwort kontinuierlich gestresster vegetativer Zellen. So wurde unter anderem das gesamte genetische Repertoire zur Synthese und Aufnahme kompatibler Solute induziert. Zusammenfassend konnte im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit das erste mechanistische Modell zur Keimungsinhibition durch Salzstress erarbeitet und die erste umfassende Transkriptom-Studie zur Salzstress-Antwort auswachsender Sporen durchgeführt werden. Diese Ergebnisse geben neue Einblicke in die Auswirkungen von Salzstress auf den Lebenszyklus von B. subtilis und könnten für die obengenannten Forschungsgebiete von angewandtem Nutzen sein.


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