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Titel: Strukturelle und biophysikalische Analyse von Adhäsionsdomänen des Flo11-Typs aus Ascomyceten
Autor: Kraushaar, Timo
Weitere Beteiligte: Essen, Lars-Oliver (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2017
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0221
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0221
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-02218
DDC: 540 Chemie
Titel(trans.): Structural and Biophysical Analysis of Adhesion Domains of the Flo11 Type from Ascomycetes

Dokument

Schlagwörter:
Biochemie, Kristallographie, Oberflächenplasmonresonanz, Saccharomyces cerevisiae, Surface Plasmon Resonance, Crystallography, Biochemistry

Zusammenfassung:
Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae verfügt über eine Reihe zellwand-verankerter Proteine, die für Zell-Zell bzw. Zell-Oberflächenkontakte zuständig sind. Diese Adhäsine oder Flokkuline genannten Proteine zeigen übereinstim-mend einen Aufbau aus A-, B- und C-Domäne, wobei die N-terminale A-Domäne für die Substratbindung zuständig ist. Die Adhäsine können grob in zwei Gruppen unterteilt werden, den PA14-Typ und den Flo11-Typ. Der PA14-Typ beinhaltet die Flokkuline Flo1, Flo5, Flo9, Flo10 und hat kennzeichnend die PA14-Domäne als Kernstruktur. Der Flo11-Typ dagegen bildet eine eigene eine eigene Pfam Familie (PF10182) und zeigt keine Homologie zu der PA14 Proteinfamilie. Die Flo11 vermittelten Phänotypen aus Saccharomyces cerevisiae zeigen eine große Diversität (Biofilme, Flokkulation, Flor-Bildung, Filamente), haben aber als gemeinsames Merkmal die Zell-Zell bzw. Zell-Oberflächen-Adhäsion. In dieser Arbeit konnte die Kristallstruktur der Flo11A Domäne aus S. cerevisiae S288C (ScFlo11A) und K. pastoris GS115 (KpFlo11A1) gelöst werden. Trotz einer geringen Sequenzidentität von 30 % zeigen beide Flo11A Domänen eine konservierte 3D-Struktur mit einer Fibronectin Typ III Domäne als Kernstruktur. Anders als die Flokkuline des PA14-Typs bindet die Flo11A Domäne keine Zuckerliganden, sondern vermittelt homotypische Flo11A-Flo11A Interaktionen über oberflächenexponierte aromatische Reste (Tryptophan und Tyrosin). Diese sind eingebettet in Gruppen von sauren Resten (Aspartat und Glutamat), sodass eine homotypische Bindung nur stattfinden kann, wenn die Domänen nahezu elektrisch neutral vorliegen. Die daraus resultierende pH-Abhängigkeit der Interaktion bildet die molekulare Grundlage der Zell-Zell-Adhäsion von Hefen untersauren Bedingungen. Mit Hilfe der Oberflächenplasmonresonanz (SPR) wurden für die beiden homotypischen Flo11A-Flo11A Interaktionen (ScFlo11A-ScFlo11A und KpFlo11A1-KpFlo11A1) KD-Werte von 20 bzw. 30 µM bei pH 5,5 bestimmt. Die heterotypische ScFlo11A-KpFlo11A Interaktion zeigte dagegen eine KD von 121 µM. Die verminderte Affinität zeigte sich vor allem in der Assoziation (kon), während die Dissoziation (koff) bei allen Inter-aktionen ähnlich war. Mit Hilfe struktureller und biophysikalischer Methoden konnte so der ungewöhnliche Adhäsionsmechanismus der Flo11A-Flo11A Interaktion aufgeklärt werden.

Summary:
The baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae harbors a set of cell wall an-chored proteins that confer cell-cell or cell-surface Interactions. These proteins called flocculins or adhesins share a common architecture consisting of an A-, B- and C-domain with the A-domain responsible for substrate binding. The ad-hesins can be divided into two independent groups, the PA14-type and the Flo11-type. The PA14-type contains the flocculins Flo1, Flo5, Flo9, Flo10 and these proteins have a central PA14 domain as core structure. The Flo11-type forms an own Pfam family (PF10182) und shows no homology to the PA14-type. The Flo11-dependent phenotypes in Saccharomyces cerevisiae show a great diversity (biofilms, flocculation, flor formation, filaments), but with adhesion to cells or surfaces as connecting element. In this work the crystal structures of the Flo11A domains from S. cerevisiae (ScFlo11A) and K. pastoris GS115 (KpFlo11A1) could be solved. Although these two Flo11A domains share a sequence identity of only 30 %, the 3D structure is highly conserved with a Fibronectin type III domain as core structure. In comparison to the flocculins of the PA14-type the Flo11A domain doesn’t bind any sugar moieties but confers homotypic Flo11A-Flo11A interactions via surface exposed aromatic residues (tryptophan and tyrosin). These aromatic residues are embedded into groups of acidic residues, namely aspartate and glutamate. Hence a homotypic interaction can only occur when both domains are almost uncharged. The resulting pH-dependence of the interaction forms the molecular basis for cell-cell adhesion of yeasts under acidic conditions. At pH 5.5 a KD value of 20 µM for the ScFlo11A-ScFlo11A interaction and 30 µM for the KpFlo11A1-KpFlo11A1 interaction could be delineated by Surface Plasmon Resonance (SPR). The heterotypic ScFlo11A-KpFlo11A interaction showed a KD of 121 µM. The reason for this reduced affinity was mainly due to a slower association (kon) while the dissociation (koff) was almost unaffected. This work could help elucidating the unusual adhesion mechanism of the Flo11A-Flo11A interaction by combining structural and biophysical methods.


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