Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg

Titel: Das DegS-DegU Zwei-Komponenten System und dessen Rolle bei der Regulation des osmotisch induzierbaren yqiHIK Operons aus Bacillus subtilis
Autor: Löbach, Stephanie
Weitere Beteiligte: Bremer, Erhard (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2016
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0099
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0099
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-00995
DDC: 570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): The DegS-DegU two-component system and its role in regulation of the osmotically inducible yqiHIK Operon of Bacillus subtilis

Dokument

Schlagwörter:
Mikrobiologie, Zellwand, Osmoregulation, cell wall hydrolases, Bacillus subtilis, two component systems

Zusammenfassung:
Die Verfügbarkeit von Wasser ist essentiell für die Entwicklung von lebenden Zellen. In den obersten Bodenschichten, dem natürlichen Lebensraum des Gram-positiven Bodenbakteriums Bacillus subtilis, ist dieser diversen Stressfaktoren ausgesetzt, die die Verfügbarkeit von Wasser beeinflussen. Trockenperioden führen zu einem hyperosmotischen Stress für die Zelle, der letztendlich die Plasmolyse der Zelle zur Folge haben könnte. Um diesen Wasserverlust zu vermeiden, ist B. subtilis in der Lage durch Synthese oder Transport kompatible Solute zu akkumulieren und sich dadurch vor den negativen Auswirkungen hoher Osmolarität/Salinität zu schützen. In Hinblick auf die zelluläre Osmoadaptation konnte aber bisher noch nicht geklärt werden wie B. subtilis Osmostress wahrnimmt. Die Stresswahrnehmung in Bakterien erfolgt oftmals über Zwei-Komponenten Systeme (TCS). In Transkriptomanalysen hyperosmotisch gestresster B. subtilis Kulturen wurde das DegS-DegU TCS als einziges salzinduzierbares System identifiziert (299). Dieses System kontrolliert eine Vielzahl von Prozessen die charakteristisch für die Übergangsphase von der exponentiellen zur stationären Phase und während zellulärer Differenzierungswege sind. Das DegS-DegU TCS konnte zwar schon als salzinduziert identifiziert werden, aber wie genau es auf osmotischen Stress reagiert konnte nicht geklärt werden. Im Verlauf meiner Promotion konnte ich mittels Reportergenanalysen die Salzinduktion des degSU Genclusters nachweisen. Weiterhin konnte ein positiver Feedback Loop von DegU~P auf den eigenen Promotor (degUP3) erstmals unter Salzstress nachgewiesen werden. Außerdem zeigte sich, dass die Expression des degUP3 Promotors nur bei hohen Salzkonzentrationen (≥ 0,8 M NaCl) erfolgt. Das DegS-DegU TCS wird durch zwei Proteine (RapG und PhrG) reguliert (236), die in dieser Studie durch Reportergenanalysen ebenfalls als salzinduziert identifiziert wurden. Die phänotypische Charakterisierung zeigte, dass die Deletion des DegS-DegU TCS unter hyperosmotischen Bedingungen zu einer geringen Verlängerung der Lag-Phase von B. subtilis Kulturen führt. Interessanterweise führte die Hyperphosphorylierung von DegU zu einem stark verbesserten Wachstum, sowohl unter isoosmotischen als auch unter hyperosmotischen Bedingungen. Dieser Phänotyp konnte nicht auf die Akkumulation des de novo synthetisierten kompatiblen Soluts Prolin zurückgeführt werden. Um eine mögliche Beteiligung von DegS-DegU in der Adaptation an hochsaline Bedingungen zu studieren, wurden die Gene, die DegU~P reguliert, in Hinblick auf ihre Salzinduktion charakterisiert. Dabei kristallisierte sich heraus, dass die Hälfte des DegU~P Regulons (197) salzinduzierbar ist, jedoch die Salzinduktion unabhängig von DegS-DegU ist. Dies zeigte sich durch Reportergenstudien der Gene aus dem Überlapp des DegU~P Regulons und des Salz-Modulons, die trotz einer Deletion des DegS-DegU TCS immer noch salzinduzierbar waren. In diesem Zusammenhang wurde das vor kurzem identifizierte Typ VII Sekretionssystem (T7SS, yukE-yueD) detaillierter analysiert. Die Deletion des T7SS führte unter hyperosmotischen Bedingungen im B. subtilis 168 Laborstamm zu keinem Phänotyp. Es zeigte sich aber, dass dessen Expression salzinduzierbar ist und durch das DegS-DegU TCS reguliert wird. Reportergenanalysen deckten auf, dass DegU~P unter pyhsiologischen Bedingungen als Aktivator und unter hyperosmotischen Bedingungen möglicherweise als Repressor agiert. Weiterhin wurde eine Beteiligung der Biofilmregulatoren SinR, ein Repressor, und RemA, ein Aktivator, nachgewiesen. Der Schwerpunkt meiner Arbeit fokussierte sich auf die Analyse der Regulation des osmotisch induzierbaren yqiHIK Operons und dessen Regulation durch das DegS-DegU Zwei-Komponenten System. Das yqiHIK Operon, welches in verschiedenen Transkriptomstudien (172, 230, 299) als stark salzinduzierbar identifiziert wurde, steht ebenfalls unter der Kontrolle des DegS-DegU TCS (86). Reportergenanalysen und ein Northern Blot zeigten, dass das Operon als eine Einheit transkribiert wird und diese salzinduzierbar ist. Weiterhin wiesen diese Analysen darauf hin, dass DegU~P in diesem Fall als Aktivator fungiert. Durch Verkürzungen einer stromaufwärts gelegenen AT-reichen Region und der gerichteten Mutagenese putativer DegU~P Bindestellen, konnte eine Bindestelle von DegU~P in einem Abstand von 203 bp zum Transkriptionsstart identifiziert werden. Durch Western Blot Analysen konnte die N-Acetylmuramyl–L-Alanin Amidase YqiI im extrazellulären Bereich lokalisiert werden und die Glycerophosphodiester Phosphodiesterase YqiK im Zytoplasma. Dies erlaubte eine neue Beschreibung der physiologischen Funktion der von yqiHIK kodierten Proteine. Die Eigenschaften des yqiHIK Promotors wurden außerdem als Hilfsmittel genutzt um die Rolle von DegS-DegU während der Osmoadaptation näher zu charakterisieren. Durch Mutationen im SigA-abhängigen Promotor von yqiHIK, die das Expressionsniveau verbessern, konnte dieser trotzdem durch Salzstress induziert werden, obwohl das DegS-DegU TCS deletiert wurde. Eine synthetisch hergestellte membrangebundene Kinase (KinC-DegS) führte ebenfalls zu einer Salzinduktion von yqiHIK, obwohl diese Hybridkinase nicht auf ein osmotisches Signal reagiert (193). Entgegen eines zuvor gemachten Vorschlags (279) konnte also in dieser Dissertation gezeigt werden, dass DegS nicht der global-agierende Salzsensor in B. subtilis ist. Das DegS-DegU System trägt aber zur Transkriptionskontrolle einer Vielzahl von Salzstress-regulierten Genen von B. subtilis bei.

Summary:
Water availability is essential for the development of living cells. In the upper layers of soil, the natural habitat of the gram-positive soil bacterium B. subtilis, it is faced to various stresses that have an influence on the availability of water. Long dry periods lead to a hyperosmotic stress that finally could cause plasmolysis. To avoid this loss of water, B. subtilis is able to accumulate compatible solutes by either transporting them or synthesizing them and to protect itself from the negative impacts of high osmolality/salinity. In terms of the osmoadaptation the big question is how B. subtilis is able to sense osmotic stress. Two component systems (TCS) play a crucial role in sensing environmental stresses. Transcriptomic data of osmotically stressed B. subtilis cells revealed that only the DegS-DegU TCS is salt inducible (299). This system controls different processes which are characteristic for the transition from the exponential to the stationary phase and for cellular differentiation procedures. The DegS-DegU TCS was identified to be salt inducible, however the exact mechanism how it reacts to osmotic stress remained unclear (299). In the course of my study reporter gene studies confirmed the salt induction of the degSU operon. For the first time the positive feedback loop of DegU~P on its own promotor (degUP3) under salt stress conditions was shown. The expression of degUP3 is only activated upon high salt concentrations (≥ 0.8 M NaCl). Reporter gene studies of two proteins (RapG and PhrG) that regulate the TCS (236), were shown to be salt inducible. Phenotypic characterisations highlighted the role of the DegS-DegU TCS during the growth of B. subtilis. The deletion of the DegS-DegU TCS lead to a slightly longer lag phase under hyperosmotic conditions. Interestingly the hyperphosphorylation of DegU leads to a strong enhancement of growth under physiological and hyperosmotic conditions. This phenotype is not due to the de novo synthesis of the compatible solute proline. To analyse a putative role of DegS-DegU in the adaptation to high salinity, genes which are regulated by DegU~P were analysed in terms of their salt induction. Here I could show that half of the DegU~P regulon (197) is salt inducible, but this induction is independent of the DegS-DegU TCS. This was schown by reporter gene analysis of genes which belong both to the DegU~P regulon as well as to the salt modulon. These genes were still salt inducible, although the DegS-DegU TCS was deleted. In conjunction with this, the recently identified type VII secretion system (T7SS, yukE-yueD) was analysed in detail. Deletion of the T7SS revealed no phenotype under hyperosmotic conditions in B. subtilis 168 laboratory strain. Reporter gene analysis showed that the T7SS is salt inducible and regulated by the DegS-DegU TCS. Under physiological conditions DegU~P acts a transcriptional activator, but under hyperosmotic conditions DegU~P seems to be a repressor. Furthermore, the involvement of the biofilm regulators SinR, a repressor, and RemA, an activator, was proven. The main focus of my studies was the analysis of the regulation of the osmotically inducible yqiHIK operon and its regulation by the DegS-DegU two component system. The yqiHIK operon, which was shown to be highly salt inducible in different transcriptomic data (172, 230, 299), is additionally regulated by the DegS-DegU TCS (86). Reporter gene and Northern blot analysis showed that yqiHIK is transcribed in one operon, which is salt inducible. Furthermore, the analysis highlighted the role of DegU~P as a transcriptional activator. Truncations of a far upstream AT-rich region and site directed mutagenesis of putative DegU~P binding sites, highlighted a DegU~P binding site at a distance of 203 bp from the transcriptional start site. The N-acetylmuramoyl–L-alanine amidase YqiI was localized by Western blot analysis in the extracellular space and the glycerophosphodiester phosphodiesterase YqiK in the cytoplasm. This results enables me to suggest a physiological function for the yqiHIK encoded proteins. The characteristics of the yqiHIK operon were further used as a device to analyse the role of the DegS-DegU TCS during the osmoadaptation. The promoter activity of the SigA-type promoter of yqiHIK was increased by site directed mutagenesis and showed a salt induction which is independent of the TCS DegS-DegU. Additionally the yqiHIK operon was still salt inducible, although the putative osmosensor was membrane bound instead of cytoplasmically localized by a synthetically produced chimeric enzyme (KinC-DegS). This chimeric enzyme does not respond to osmotic stresses (193). Contrary to a prior hypothesis (279), I could show that DegS is not the globally-acting salt sensor in B. subtilis. The DegS-DegU TCS however contributes to the transcriptional control of a multitude of salt stress regulated genes in B. subtilis.


* Das Dokument ist im Internet frei zugänglich - Hinweise zu den Nutzungsrechten