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Titel: Bio-synthesised LytC protein kills bacteria and the study of protein dynamics in B. subtilis
Autor: Cao, Mingle
Weitere Beteiligte: Graumann, Peter (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2016
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0045
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0045
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-00453
DDC: 540 Chemie
Titel(trans.): Lösliches LytC protein tötet Bakterien ab und Studie von Protein-Dynamiken in Bacillus subtilis

Dokument

Schlagwörter:
LytC, MreB, Einzelmolekülbewegung, Einzelmolekülverfolgung, LytC, MreB, Einzelmolekülbewegung, Einzelmolekülverfolgung, LytC, MreB, Dynamics, Single Molecule Tracking

Summary:
For many years, efforts for discovering new antibiotics were mainly focused on the inhibitors of the cell wall synthesis machinery. We tried to find other antibiotics that target the cell wall by making use of the cell wall degradation enzymes, which lyse the cell wall and therefore kill bacteria. LytC is an autolysin from B. subtilis, which is capable of degrading the bacterial cell wall and make it a potential candidate antibiotic. In this dissertation, I cloned B. subtilis lytC gene and over-expressed LytC protein in E. coli. In order to characterize the function of different LytC regions, we designed different constructs of lytC. I used the Gram-negative bacterium E. coli and Gram-positive B. subtilis to test if LytC can degrade the cell wall components when used as an external additive in cell medium. Different constructs of purified LytC protein were used, the results showed that LytC constructs can efficiently and greatly inhibit the growth of E. coli and B. subtilis, yet it is only effective for exponentially growing cells. The cell wall of stationary cells was more resistant to LytC and cell lysis was not observed. I proved that the C-terminal fusion of LytC with a strep-tag can be successfully over-expressed and purified while the N-terminal fusion cannot. Overexpression of LytC leads to a fast drop in OD600 after one hour induction with 0.5 mM IPTG. The construct of LytCF6 only contains the functional region and the purified protein can still function like full length protein, which means the four cell wall binding (CWB) and the „low complexity region“ (LCR) domains are not necessary for LytC activity. I used strep elution buffer with BSA (bovine serum albumin) as control to verify that it is the LytC protein that is responsible for cell growth inhibition. I deleted 22 amino acids from the C-terminus of the functional region, and protein activity of this partially deleted LytCF2R2 was compared with LytCF2 (which has the full length of functional region). As a result, LytCF2R2 lost almost half of the protein activity in comparison to LytCF2. This further demonstrates that LytCF2 contains the functional region and the deletion of it can result in loss of activity. We reviewed the localization and the single molecule trajectories of proteins (MreBCD, Pbp1A, RodZ and PDH complex) in exponentially grown B. subtilis cells. Phosphofructokinase (PfkA), which is a fast moving protein, was used as a control for MreB in the single molecule tracking study. In the protein localization study, we found that MreB, MreC, MreD, RodZ and Pbp1A are localized along the cell membrane and have a similar localization pattern. The results indicate that MreB, MreC, MreD, RodZ and Pbp1A are membrane proteins. We confirmed the phenomenon that MreB forms discontinuous filaments structure underneath the cell membrane, both in B. subtilis and in E. coli. Upon reduction in its expression level, MreB forms patchy and short filament structures in B. subtilis. MreC and MreD also form patchy spots structures besides the membrane staining pattern. From our calculation, two thirds cells have PdhA localized at one cell pole, one third of the cells does not contain PdhA spots. The localization studies of PdhB, PdhC and PfkA showed that they are all uniformly distributed within the cytoplasm of the cell, which indicates they are cytoplasmic proteins. PdhD has two localization patterns, one is the same as chromosome DNA staining, and the other one is uniformly distributed within the cytoplasm. We found single molecules of MreB are composed of two populations. One is the immobile population that forms the filamentous structures. The other one is the mobile population that freely diffuses within the cell. The same conclusions apply to the Pbp1A and PDH subunits proteins, as well as for the MreB colocalized proteins (MreC, MreD and RodZ). The single molecules of the PfkA compose two mobile populations. The fraction and movement speed of MreB mobile single molecules are lower than those of PfkA. We also deduced that MreB is a membrane-associated protein and that PdhC (E2 subunit) is the core of PDH complex from our data analysis, because the fraction and diffusion coefficient of mobile PdhC single molecules are the slowest of the four PDH subunits.

Zusammenfassung:
Eine Vielzahl von Antibiotika greifen in die Zellwandsynthese ein. Gegen fast alle gängigen Antibiotika existieren Resistenzen, die von einem Bakterium in das andere weitergegeben werden können. Daher wollten wir eine alternative Strategie verfolgen und Zellwand-degradierende Enzyme einsetzten, um Bakterien durch externe Zugabe zu lysieren. LytC iste in sogenanntes Autolysin von Bacillus subtilis, das in der Lage ist, Brüche in die Zellwand einzuführen, und ist ein Kandidat für unsere Strategie. Ich habe das lytC Gen kloniert und das Protein in E. coli Zellen überproduziert, und anschließend aufgereinigt. Um die Funktion der verschiedenen LytC Domänen zu untersuchen, haben wir unterschiedliche Konstrukte von LytC hergestellt. LytC besitzt eine “low complexity region” (LCR), vier Zellwand-Bindedomänen (CWB) und eine funktionale Hydrolase Domäne. Ich habe das Gram negative Bakterium E. coli und den Gram positiven Organismus B. subtilis verwendet, um zu untersuchen, ob extern zugegebenes LytC zur Zelllyse führen kann. Die Ergebnisse zeigten dass LytC effizient das Wachstum beider Organismen hemmen kann, wobei dieser Effekt nur in der exponentiellen Wachstumsphase zu beobachten war. Eine C-terminale Fusion von LytC mit einem Strepavidin-tag konnte effizient überproduziert und gereinigt werden, ein N-terminaler nicht. Die Überexpression von LytC führte zu einem schnellen Absinken der optischen Dichte, eine Stunde nach Induktion der Transkription. Das LytCF6 Konstrukt bestand nur aus der Hydrolase Domäne und konnte Zelllyse herbeiführen, was zeigt, dass die CWD und die LCR Domänen nicht essentiell für die Aktivität sind. Kontrollversuche mit BSA oder Elutionspuffer belegten, dass die Aktivität spezifisch für LytC ist. Eine Deletion von 22 Aminosäuren von C-Terminus der funktionalen Domäne führten zu einer starken Reduktion der lytischen Aktivität, was zusätzlich belegt, dass die wachstumshemmende Aktivität von LytCF2 stammt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Lokalisation und die Einzelmolekülbewegungen von Proteinen MreB, MreC, MreD, Pbp1A und RodZ, die an der Zellmorphologie in vielen Bakterien beteiligt sind, und den Untereinheiten der Pyruvat-Dehydrogenase (PDH) und der Phosphofruktokinase (PfkA) als zytosolische Proteine untersucht. Die Morphologie-Proteine sind entweder Membran-integral, oder Membran-assoziiert, was die Lokalisation der fluoreszierenden Fusionsproteine bestätigte. MreB aus B. subtilis und aus E. coli bildete, wie zuvor beschrieben, filamentöse Strukturen an der Zellmembran aus. Eine Reduktion des Expressionsniveaus von MreB führte zur Ausbildung kurzer Filamente und diffuser Aggregate. MreC und MreD interagieren mit MreB und lokalisierten in punktuellen Mutsren innerhalb der Membran. Die PDH Untereinheiten PdhB, PdhC und die PfkA wiesen homogene Lokalisation in der Zelle auf, im Einklang mit einer zytosolischen Enzym-Funktion. Interessanterweise lokalisierte PdhA an nur einem Zellpol in zwei Dritteln der Zellen, und PdhD wies zwei Lokalisationsmuster auf, ein homogen zytosolisches, und eines, dass mit der Lokalisation der Chromosomen im Nukleoid überein stimmte. Dem entsprechend haben zwei der vier Untereinheiten der PDH eine spezifische Lokalisation in B. subtilis Zellen. Durch Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie und automatisierter Molekülverfolgung konnte bestimmt werden, dass MreB Moleküle zwei Populationen ausbilden, eine eher immobile Population, die in den filamentösen Strukturen vorhanden ist, und eine bewegliche aus diffundierenden Molekülen. Die Mehrheit der MreB Moleküle ist immobil und damit in filamentöser Struktur. Auch MreC, MreD und RodZ, sowie Pbp1A und die PDH Untereinheiten wiesen eine statische und eine dynamische Population auf, nur PfkA zeigte zwei dynamische Populationen, die vermutlich aus einer Population langsamer und schnell diffundierender Proteine besteht. Die Diffusionsgeschwindigkeit der der dynamischen MreB Moleküle ist deutlich niedriger als die der PfkA Moleküle, was vermuten lässt, dass MreB hauptsächlich entlang der Membran diffundiert, was die Diffusion verringert. Die E2 Untereinheit der PDH, PdhC, scheint die zentrale Untereinheit der PDH zu sein, da sie die geringste Diffusionskonstante der vier Untereinheiten aufwies, und daher die meisten PdhC Moleküle im Komplex gebunden sind, während die übrigen in höherem Masse zwischen freier und gebundener Form wechseln.


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