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Titel:Synthesis, Identification, Kinetic, and Structural Characterization of Inhibitors of the Aspartic Proteases HTLV-1 Protease and Endothiapepsin
Autor:Kuhnert, Maren Sophia
Weitere Beteiligte: Diederich, Wibke (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2015
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2015/0372
DOI: https://doi.org/10.17192/z2015.0372
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2015-03728
DDC: Medizin
Publikationsdatum:2015-09-03
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Proteasen, enzyme inhibitor, Aspartylproteasen, drug design, Inhibitor, aspartic proteases, HTLV-1-Proteaseinhibitor, Enzym, X-ray crystallography, Indinavir, Wirkstoffdesign, Proteinkristallographie

Summary:
This thesis focuses on the identification and synthesis as well as kinetic and structural characterization of non-peptidic small molecule inhibitors of the two aspartic proteases HTLV-1 protease (HTLV-1 PR) and endothiapepsin. The HTLV-1 PR, a promising target for the treatment of viral infections caused by the human T-cell leukemia virus type-1, is related to the well-known HIV-1 PR, however, it exhibits a substantially different substrate specificity and inhibition profile than the latter. However, due to the similarity in the active site, HIV-1 PR inhibitors provide a promising starting point for the identification and further optimization of novel small molecule inhibitors against HTLV-1 PR. First, after successful establishment of an in-house HTLV-1 protease technology platform, the well-known HIV-1 PR inhibitor indinavir, which displays a Ki-value in the one-digit micromolar range (3.5 µM) against the HTLV-1 PR, was chosen as auspicious starting point although in comparison to the HIV-1 PR (540 pM) its affinity is strongly reduced. However, other highly potent HIV-1 protease inhibitors (saquinavir, ritonavir, nelfinavir, and amprenavir) do not show any relevant affinity against HTLV-1 protease (Ki > 20 μM). Within this thesis the X-ray structure of indinavir in complex with the HTLV-1 PR was determined at 2.40 Å resolution, representing, to the best of our knowledge, the first HTLV-1 PR crystal structure with a non-peptidic inhibitor. This structural information laid the foundation for rationalizing the rather moderate affinity of indinavir against the HTLV-1 PR and thus provided the basis for further structure-guided optimization strategies. As a second approach for lead identification, the privileged structure concept was exploited as tool to identify novel small molecule scaffolds for HTLV-1 PR inhibition. A screening of our in-house aspartic protease inhibitor library was performed and resulted in the identification of C2-symmetric 3,4-bis-N-alkylsulfonamido-pyrrolidines and pyrrolidine-based bicyclic HIV-1 PR inhibitors as promising candidates for HTLV-1 PR inhibition. Both inhibitor classes were characterized in more detail regarding their kinetic as well as structural properties. Out of a series of ten 3,4-bis-N-alkylsulfonamido-pyrrolidine inhibitors, AB84 exhibits an affinity of 15 nM (Ki-value) and represents, to the best of our knowledge, the most potent non-peptidic inhibitor of HTLV-1 PR described so far. The successfully determined crystal structures of AB84 and another representative of this inhibitor series, enabled structure-guided SAR interpretations thus laying the foundation for the deduction of design ideas for further optimization of this inhibitor scaffold. The pyrrolidine-based bicyclic compounds exhibit affinities from the three-digit up to the one-digit micromolar range, the most potent inhibitor of this series (Ki-value: 1.4 µM) is substituted with two benzhydryl moieties. A crystal structure of this inhibitor series was determined with NK101. Based on these fundamental insights and the deduced SAR described in this thesis, both scaffolds represent promising starting points for the further inhibitor optimization utilizing structure-based drug design. The second part of this thesis deals with the aspartic protease endothiapepsin that serves as a model system for aspartic proteases in general. Various 2-aminothiophene compounds were synthesized as inhibitors of endothiapepsin utilizing the Gewald reaction. Surprisingly, the binding mode analysis of eight similar 2-aminothiophene inhibitors resulted in four completely different binding modes, hence, explaining retrospectively, why the initial deduction of the SAR based on the obtained affinity data had failed. Moreover, we could demonstrate that discrepancies between affinity data based on enzyme kinetics and TSA results within one inhibitor series may be exploited as a hint for putative changes in the adopted binding geometry. The presented example highlights the complexity of binding events, their strong dependence on seemingly minor effects of the scaffold decoration and the necessity to continuously monitor binding modes during the hit-to-lead optimization process.

Zusammenfassung:
Diese Arbeit umfasst die Identifizierung und Synthese sowie enzymkinetische und strukturelle Charakterisierung von nicht-peptidischen Kleinmolekülen als Inhibitoren der beiden Aspartylproteasen HTLV-1-Protease und Endothiapepsin. Die HTLV-1-Protease stellt ein vielversprechendes Zielenzym für die Behandlung von viralen Infektionen mit dem Humanen T-Zell-Leukämie-Virus (HTLV) dar und ist eng verwandt mit der bekannteren HIV-1-Protease. Trotz struktureller Ähnlichkeit beider Proteasen unterscheiden sich diese jedoch deutlich voneinander hinsichtlich ihrer Substrat- und Inhibitorspezifität. Jedoch stellen auf Grund der Ähnlichkeiten im aktiven Zentrum einige der bereits bekannten HIV-1-Protease-Inhibitoren einen geeigneten und vielversprechenden Startpunkt für die Identifizierung und Optimierung von neuartigen Kleinmolekülen zur Inhibition der HTLV-1-Protease dar, über deren Bindungsmodus vor Aufnahme dieser Arbeiten allerdings noch nichts bekannt war. Nach erfolgreicher in-house-Etablierung der Expression, der Proteinreinigung, eines Affinitätsassays sowie geeigneter Kristallisationsbedingungen für die HTLV-1-Protease wurde zunächst der bekannte HIV-1-Protease-Inhibitor Indinavir, der gegenüber der HTLV-1-PR eine Affinität im einstellig mikromolaren Bereich aufweist, näher untersucht. Die Affinität (Ki: 3,5 µM) gegenüber der HTLV-1-Protease ist im Vergleich zur HIV-1-Protease (540 pM) zwar deutlich geringer, jedoch weisen andere hoch-affine HIV-1 PR-Inhibitoren (Saquinavir, Ritonavir, Nelfinavir und Amprenavir) keine nennenswerte Affinität gegenüber der HTLV-1-Protease auf (Ki > 20 µM). Im Rahmen dieser Arbeit konnte mit der Kristallstruktur von Indinavir im Komplex mit der HTLV-1-Protease die nach unserem Wissen erste HTLV-1-Protease-Kristallstruktur mit einem nicht-peptidischen Inhibitor beschrieben werden. Die so erhaltenen strukturellen Informationen tragen maßgeblich zum Verständnis der moderaten Affinität von Indinavir gegenüber der HTLV-1-Protease bei und legten darüber hinaus den Grundstein für weitere strukturbasierte Optimierungsansätze. In einem zweiten Ansatz zur Leitstrukturidentifizierung wurde das Konzept der „privilegierten Strukturen“ zur Identifizierung neuartiger niedermolekularer Grundgerüste für die HTLV-1 PR-Inhibition verfolgt. Durch Screening der Arbeitskreis-internen Substanzbibliothek verschiedener Aspartylproteaseinhibitoren konnten C2-symmetrische 3,4-bis-N-alkylsulfonamid-substituierte Pyrrolidine sowie bizyklische Pyrrolidine als vielversprechende Kandidaten zur Inhibition der HTLV-1-Protease identifiziert werden. Beide Inhibitorklassen wurden ursprünglich als HIV-1-Protease-Inhibitoren entwickelt und im Rahmen dieser Arbeit bezüglich ihrer enzymkinetischen und strukturellen Eigenschaften gegenüber der HTLV-1-Protease genauer untersucht. Aus einer Serie mit zehn C2-symmetrischen 3,4-bis-N-alkylsulfonamid-substituierten Pyrrolidinen stellt die Verbindung AB84 mit einer Affinität von 15 nM nicht nur den affinsten Vertreter dieser Serie, sondern, nach bestem Wissen, auch den bislang affinsten nicht-peptidischen HTLV-1-Protease-Inhibitor dar. Die erfolgreiche Bestimmung der Kristallstrukturen von AB84 sowie einem weiteren Vertreter dieser Inhibitorklasse, ermöglichte ebenfalls die strukturbasierte Interpretation der Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR). Die bizyklischen Pyrrolidin-basierten Inhibitoren weisen Affinitäten im drei- bis einstellig micromolaren Bereich auf, wobei eine mit zwei Benzhydrylgruppen substituierte Verbindung den bisher aktivsten Vertreter dieser Inhibitorserie (Ki: 1,4 µM) darstellt. Eine Kristallstruktur dieser Verbindungsklasse wurde mit NK101 erfolgreich bestimmt. Basierend auf den erhaltenen, grundlegenden Erkenntnissen über den Bindungsmodus sowie der abgeleiteten SAR bieten beide Grundgerüste vielversprechende Optionen für die weitere strukturbasierte Leitstrukturoptimierung. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Aspartylprotease Endothiapepsin, einem bekannten Modellenzym für Aspartylproteasen. Verschiedene Verbindungen mit einem 2-Amino-Thiophen Grundgerüst wurden basierend auf der Gewald-Reaktion synthetisiert. Überraschenderweise wurden innerhalb einer Serie von acht strukturell sehr ähnlichen Liganden vier verschiedene Bindungsmodi gefunden, was im Nachhinein erklärt, warum die auf den Affinitätsdaten und der Kristallstruktur der Leitstruktur basierte SAR nicht schlüssig interpretiert werden konnte. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Unstimmigkeiten bei der Korrelation von klassischen Affinitäts- mit TSA-Daten einen Hinweis auf eine geänderte Bindungsgeometrie liefern können. Die hier präsentierte Fallstudie unterstreicht eindrucksvoll die Komplexität des Bindungsgeschehens von Liganden, dessen Abhängigkeit von kleinsten chemischen Veränderungen am Substitutionsmuster einer Leitstruktur und die Notwendigkeit der kontinuierlichen Überwachung der Bindungsmodi während einer Leitstrukturoptimierung.


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