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Summary:
In der vorliegenden Arbeit werden kapillarelektromigrative Trennmethoden als alternative Strategien zu existierenden Verfahren zur Bestimmung extrem hydrophiler Analyte untersucht. Es wird gezeigt, dass die entwickelte Methodik (unter Einschluss unterschiedlicher on-line und off-line Anreicherungstechniken) sich sowohl zur Analyse von biologischen Flüssigkeiten als auch zur Analyse von Umweltproben eignet. Für diese Studie wurden daher als polare Analyte im Urin enthaltene Nukleoside und als mögliche Umweltkontaminanten diskutierte α-Aminocephalosporine als Modell-Analyte gewählt. Nukleoside verfügen über eine cis-Diol-Struktureinheit, die es ihnen bei alkalischem pH ermöglicht, negativ geladene Komplexe mit Tetrahydroxyborat-Ionen zu bilden. Über die effektive elektrophoretische Mobilität wird gezeigt, dass der Komplexierungsgrad sogar bei sehr geringer Tetraborat-Konzentration (2,5 mmol L-1) nahe 1 liegt. Weil die für die untersuchten Nukleoside mit Kapillarzonenelektrophorese (CZE) unter Verwendung eines Borat-Borsäure-Puffers erreichbare Auflösung nicht ausreichend ist, sind zur vollständigen Trennung der untersuchten Nukleoside alternative Herangehensweisen erforderlich: (i) ein anderer Trennmodus oder (ii) Pufferadditive, die eine veränderte Trennselektivität ermöglichen. In einem ersten Schritt wird daher zunächst ein Verfahren entwickelt, welches mizellare elektrokinetische Chromatographie (MEKC) mit dem kationischen Tensid 1-Tetradecyl-3-methylimidazoliumbromid (C14MImBr) in Gegenwart von Tetrahydroxyborat zur Trennung von in Urin enthaltenen Nukleosiden (nach Konversion in eine ionische Spezies) nutzt. Eine vollständige Trennung der hydrophilen Metabolite ist bereits bei geringer Konzentration des kationischen Tensids C14MImBr (20 mmol L-1) möglich (Hintergrundelektrolyt 5 mmol L-1 Dinatriumtetraborat, pH 9,38). Es wird untersucht, welche Gleichgewichte bei Verwendung von C14MImBr als kationischem Tensid für die Trennung der im Urin enthaltenen Nukleoside und die Steuerung des Retentionsfaktors (entgegengesetzt geladene PSP) verantwortlich sind. Es wird gezeigt, dass die negativ geladenen komplexierten Nukleoside mit den C14MImBr Mizellen hauptsächlich elektrostatische Wechselwirkungen eingehen, während hydrophobe Wechselwirkungen als vernachlässigbar betrachtet werden können. Diesem Ergebnis entspricht, dass erhöhte Retentionsfaktoren sowohl mit reduzierter Borat-Konzentration als auch mit heraufgesetztem pH-Wert erhalten werden. Unter Bedingungen maximaler Nukleosid-Mizell-Wechselwirkung (quantifiziert durch Ermittlung der Gleichgewichtskonstanten) wird unter Rückgriff auf kombinierte on-line Anreicherungstechniken ein optimiertes und vollständig validiertes MEKC Verfahren zur Identifizierung und Quantifizierung von Nukleosiden in Urin-Proben entwickelt. Es wird gezeigt, dass “pseudostationary ion-exchanger” sweeping hauptsächlich für den beobachteten Anreicherungsprozess verantwortlich ist. C14MImBr kann jedoch aufgrund der niedrigen Retentionsfaktoren für Adenosin (Ado) and Cytidin (Cyd) nicht effizient für das Sweeping dieser Analyte eingesetzt werden. Außerdem komigrieren diese Nukleoside mit Bestandteilen der Urin-Matrix. Daher wurde zusätzlich das anionische Tensid SDS für ein Alternativverfahren zur Bestimmung von Ado und Cyd nach Überführung in kationische Spezies (unter sauren pH-Bedingungen) unter Verwendung von “pseudostationary ion-exchanger” sweeping als on-line Anreicherungsprinzip herangezogen. Dieses Alternativverfahren wurde erfolgreich angewendet, um Ado und Cyd in Urinproben zu bestimmen. Ergänzend wurde nachgewiesen dass mit einem Hintergrundelektrolyten, der ein Alkyl- oder Arylboronat zusätzlich zu C14MImBr enthält, die Retentionsfaktoren aller untersuchten Nukleoside signifikant erhöht sind. Diese Verschiebung der Retentionsfaktoren zu höheren Werten wird der Wechselwirkung mit der zusätzlich über die Alkyl/Aryl-Gruppe des Boronats eingeführten hydrophoben Struktureinheit zugeschrieben (Komplexbildung des Boronats mit der cis-Diol-Gruppe des Nukleosids). Es wird gezeigt, dass die entwickelten Optimierungsstrategien in validierten Verfahren genutzt werden können, die eine Identifizierung und Quantifizierung der untersuchten Nukleoside in Urin-Proben ermöglichen (Nachweisgrenzen im Bereich von 0,1-0,2 mg L-1). In einem zweiten Schritt wird 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (2-HP-β-CD) als Puffer-Additiv in einem Borat-Borsäure-Puffer verwendet. Dieses Additiv ermöglicht eine Modifizierung der Trennselektivität und eine vollständige Trennung der untersuchten Nukleoside via CZE. Unter Nutzung der sehr hohen Komplexbildungskonstante zwischen Nukleosid und Tetrahydroxyborat unter gleichzeitiger Verwendung des selektivitätsmodifizierenden Additivs 2-HP-β-CD wird ein sehr empfindliches CZE-Verfahren entwickelt, dessen Nachweisgrenzen 10-40 μg L−1 erreichen. Dieses Verfahren stützt sich auf eine mehrstufige on-line Anreicherung unter Einbeziehung von dynamic pH junction, borate sweeping und large volume sample stacking (LVSS). Eine Validierung wird gemäß den Leitlinien der ICH durchgeführt. Das validierte Verfahren wird erfolgreich auf die Identifizierung und Quantifizierung von Nukleosiden in gespiktem und ungespiktem Urin angewandt. Die Ergebnisse dieses Teils der Untersuchungen werden nachfolgend auf die Analyse ausgewählter α-Aminocephalosporine in Oberflächenwasser übertragen. Unter Hinzuziehung einer hochempfindlichen Detektionsmethode (Laser-induzierte Fluoreszenz (LIF) Detektion) wird CZE mit LVSS-sweeping zur Analyse von Cefalexin und Cefadroxil in gespiktem Lahnwasser genutzt (Nachweisgrenzen 5-8 ng L-1).

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