Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zu 2-Oxoglutarat abhängigen Dioxygenasen in Equisetum arvense L. und Petroselinum crispum (Mill.) Nyman & A.W. Hill

In der vorgelegten Arbeit wurden 2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenasen aus dem Flavonoidstoffwechsel - unter besonderer Berücksichtigung der FNS I, FLS und ANS - von Equisetum arvense und Petroselinum crispum untersucht. E. arvense ist einer phylogenetisch sehr alten Gattung zuzuordnen und enthält e...

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1. Verfasser: Bredebach, Miriam
Beteiligte: Matern, Ulrich (Prof. Dr. Dr. h.c. ) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2013
Pharmazeutische Biologie
Ausgabe:http://dx.doi.org/10.17192/z2013.0081
Schlagworte:
FLS
FNS
FHT
Online Zugang:PDF-Volltext
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Zusammenfassung:In der vorgelegten Arbeit wurden 2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenasen aus dem Flavonoidstoffwechsel - unter besonderer Berücksichtigung der FNS I, FLS und ANS - von Equisetum arvense und Petroselinum crispum untersucht. E. arvense ist einer phylogenetisch sehr alten Gattung zuzuordnen und enthält eine große Zahl unterschiedlicher Flavonoide, die bereits gut erforscht sind (Saleh et al., 1971, Veit et al., 1995). Der Flavonoidstoffwechselweg in der Pflanze ist jedoch noch ungeklärt. In der hier vorgelegten Arbeit konnten im Enzymrohextrakt verschiedene 2-ODD-Aktivitäten nachgewiesen werden. Neben einer FHT- und FLS-Reaktion wurde zweifelsfrei auch eine FNS I-Aktivität bestimmt und konnte in Ansätzen charakterisiert werden. Dies ist ein erster Beweis, dass die Bildung von Flavonen mittels 2-ODD nicht allein auf die Familie der Apiaceae beschränkt ist. Der Versuch allerdings, die verantwortlichen Enzyme durch Proteinreinigung zu isolieren und funktionell zu charakterisieren, scheiterte aber an der Instabilität der Proteine. Ebenso konnte die schnell abnehmende katalytische Aktivität auch mit spezifischer Affinitätschromatographie nicht angereichert werden. Dahingegen konnten zwei 2-ODDn-cDNA-Sequenzen erfolgreich kloniert und exprimiert werden. Hierbei wurden Klonierungen mittels RT-PCR und cDNA-Bank-Screening durchgeführt. Da die exprimierten Proteine funktionell nicht mit den angebotenen Substraten identifiziert werden konnten, konnten diese evolutionär nicht verglichen werden. Auch mit Hilfe der phylogenetischen Analyse und aufgrund einer niedrigen Identität von 30 % zu anderen 2-ODDn konnte keine Aussage über die enzymatische Funktion getroffen werden. Die strukturelle Analyse der Polypeptid-Sequenzen und der genomischen Strukturen weist widersprüchliche Ergebnisse auf. Auf diese Weise kann nicht eindeutig geklärt werden, ob es sich bei den exprimierten cDNA-Sequenzen um 2-ODDn aus dem Flavonoidstoffwechsels handelt. Es ist dennoch wahrscheinlich, dass die klonierten Sequenzen für 2-ODDn kodieren. Der zweite Untersuchungsgegenstand war die Flavonoidbiosynthese der Petersilie, bei der durch Trockenstress die Bildung roter Farbstoffe im Stängel erreicht werden konnte. Diese konnten als Anthocyane identifiziert werden, die ausschließlich in gestressten Pflanzen zu finden waren und als Glykoside der Aglyka Cyanidin und Peonidin identifiziert werden konnten. Als verantwortliches Enzym der Anthocyanidin-Synthese, konnte die ANS aus P. crispum mittels RT-PCR und RACE-Technik erfolgreich kloniert und exprimiert werden. In Biotransformationen mit Bakterienkulturen konnte die für ANS bereits mehrfach nachgewiesene Nebenreaktion von Dihydroflavonolen zu Flavonolen (Welford et al., 2001; Turnbull et al., 2004) bestätigt werden. Die Hauptreaktion von Leukoanthocyanidinen zu Anthocyanidinen konnte jedoch weder in in vitro Enzymtests noch in Biotransformationen nachgewiesen werden. Zur Abgrenzung von ANS-Sequenzen gegenüber FLS-Sequenzen wurde auf molekulargenetischer Ebene die genetische Information weiter untersucht und es wurden verschiedene Polypeptid-Strukturanalysen durchgeführt. Sowohl Alignments der Polypeptid-Sequenzen von PcFLS und AtANS, die Phylogenie-Analyse als auch die Untersuchung des genomischen Klons und Analyse der Intronlage bestätigten das Vorliegen einer ANS. Weiter konnte mit Hilfe der semiquantitativen PCR gezeigt werden, dass Transkripte, die zunächst in ungestresst kultivierter Petersilie nachweisbar waren, in Petersilie, die unter Trockenstress kultiviert worden war, abnahmen oder sogar nicht mehr detektiert werden konnten. Lediglich das für die ANS kodierende Transkript konnte gleichbleibend detektiert werden, während das Transkript des DFR-Gens erst unter Trockenstress nachweisbar wurde. Dies bestätigte die de novo Synthese der Anthocyane auf Expressionsebene, die bereits durch die Inhaltsstoffanalytik angenommen worden war.
DOI:http://dx.doi.org/10.17192/z2013.0081