Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg

Titel:Rationale Strategien zur Isolierung bakterieller Lassopeptide - Struktur, Biosynthese und Anwendungspotential
Autor:Knappe, Thomas
Weitere Beteiligte: Marahiel, Mohamed A. (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2011
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0098
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-00985
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0098
DDC: Chemie
Titel(trans.):Rational strategies for the isolation of bacterial lasso peptides - structure, biosynthesis and applications
Publikationsdatum:2011-05-12
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Molecular scaffold, Peptidgerüste, Biosynthese, Genome mining, Peptidantibiotikum, Lasso peptides, Lassopeptide, Peptide antibiotics, Biosynthesis, Genomisches Mining

Zusammenfassung:
Bakterielle Lassopeptide sind ribosomal synthetisierte, bioaktive Peptide, die sich aus 16 bis 21 proteinogenen Aminosäuren zusammensetzen. Sie zeichnen sich durch eine verzweigt-zyklische Primärstruktur aus, die durch einen N-terminalen Makrolaktamring und einen linearen C-Terminus charakterisiert ist. Der C-Terminus ist nicht frei beweglich, sondern durch den makrozyklischen Ring hindurch gefädelt und dabei entweder durch sterische Hinderung voluminöser Aminosäureseitenketten oder kovalent durch Disulfidbindungen verankert. Die daraus resultierende Lassostruktur führt zu einer außerordentlichen Stabilität gegenüber Proteasen, hohen Temperaturen und chemischen Denaturierungsmitteln und begründet in Kombination mit der genetischen Kodierung und bakteriellen Herkunft das steigende Interesse an diesen einzigartig strukturierten Peptiden. In dieser Arbeit wurde ein auf Genomischem Mining basierendes Verfahren zur Identifizierung neuer Lassopeptidbiosynthesecluster in Bakterien entwickelt. Mit Hilfe dieser Strategie konnte ein kryptisches Gencluster im Genom von Burkholderia thailandensis E264 identifiziert und eine Verbindung mit der Masse des postulierten Lassopeptids im Kulturüberstand nachgewiesen werden. Strukturuntersuchungen mittels Massenspektrometrie und NMR-Spektroskopie belegten die Lassostruktur der isolierten Verbindung, die Capistruin genannt wurde. Das 19-AS Lassopeptid, das eine antibakterielle Aktivität gegen Vertreter des pathogenen Burkholderia cepacia-Komplexes zeigte, konnte durch Expression des Genclusters in Escherichia coli heterolog produziert werden. Die anschließende Mutationsanalyse des ribosomalen Vorläuferproteins führte zur Identifizierung von vier Positionen innerhalb der Lassopeptidsequenz, die kritisch für die Reifung des Peptids waren. Innerhalb des Leaderpeptids erwies sich Threonin an der P2-Position der Proteaseschnittstelle als essentiell für die Prozessierung des Vorläufers. Durch eine Stabilitätsanalyse ausgewählter Capistruinvarianten wurden Einblicke in Struktur-Stabilitäts-Beziehungen erhalten und Arg15 als der für die Verankerung des C-Terminus verantwortliche Rest identifiziert. Ferner wurde mit Capistruin R15A/F16A das erste temperatursensitive Lassopeptid generiert, das thermisch in eine verzweigt-zyklische Struktur entfaltet werden kann. Darüber hinaus wurden die zwei verzweigt-zyklischen Peptide BI-32169 und Anantin massenspektrometrisch und NMR-spektroskopisch untersucht. Dabei konnte für beide Peptide die postulierte Lassostruktur bewiesen werden, die aufgrund der Ähnlichkeit ihrer Primärstruktur mit der von Lassopeptiden vermutet worden war. Der Glucagonrezeptorantagonist BI-32169 unterscheidet sich dabei von den bisherigen Lassopeptiden der Klassen I und II und kann daher als Begründer der neuen Klasse III angesehen werden. Die relaxierte Substratspezifität der Biosynthesemaschinerie von Lassopeptiden legte eine Verwendung der stabilen Peptidgerüste zur Präsentation von Pharmakophoren nahe, um die intrinsischen Stabilitätseigenschaften mit den Funktionen bioaktiver Epitope zu kombinieren. Die Konversion des Lassopeptids MccJ25 in einen nanomolaren Inhibitor von avb3 und avb5 Integrinen mit anti-angiogenetischer Wirkung durch die Insertion des Integrinbindungsmotivs RGD in das stabile Peptidrückgrat verdeutlicht dieses bisher ungenutzte Potential lassostrukturierter Peptide. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern einen Einblick in die Struktur, Stabilität und Biosynthese von bakteriellen Lassopeptiden und werden in Zukunft das Genomische Mining nach lassostrukturierten Peptiden erleichtern und damit zur Identifizierung von neuen, alternativen Peptidgerüsten beitragen, die zur Präsentation von bioaktiven Epitopen verwendet werden können.

Summary:
Bacterial lasso peptides are ribosomally assembled, bioactive peptides consisting of 16 - 21 proteinogenic amino acids. They share a branched cyclic primary structure characterized by an N-terminal macrolactam ring and a linear exocyclic C-terminus, which is threaded through the macrocycle and trapped either by steric hindrance of bulky side chains or covalently via disulfide bonds. The resulting lasso structure shows a remarkable stability towards proteolytic degradation, high temperatures and chemical denaturants and accounts in combination with the genetic encoding and the bacterial origin for the increasing interest in these unique structured peptides. In this study a genome mining based approach for the identification of novel lasso peptide biosynthetic gene clusters in bacteria was developed. Using this rational approach a cryptic gene cluster was identified in the genome of Burkholderia thailandensis E264 and a compound matching the predicted mass of the postulated lasso peptide could be detected in culture supernatants. Structural studies applying mass spectrometry and NMR spectroscopy confirmed the lasso structure of the isolated compound, which was named capistruin. The 19-aa lasso peptide showed antibacterial activity against members of the pathogenic Burkholderia cepacia complex and could be produced heterologously in Escherichia coli upon expression of the entire biosynthetic gene cluster. Subsequent mutational analysis of the ribosomal precursor protein led to the identification of four positions within the lasso sequence being critical for the maturation of the peptide. Inside the leader peptide a threonine residue at the P2 position of the protease cleavage site was found to be essential for the processing of the precursor. Stability studies of selected capistruin variants gave insights into structure stability relationships and identified Arg15 as the residue which is solely responsible for the trapping of the C-terminus within the 9-residue macrolactam ring. In addition, the capistruin R15A/F16A variant was the first temperature sensitive lasso peptide which could be thermally unfolded into a branched-cyclic structure in vitro. Furthermore, the branched-cyclic peptides BI-32169 and anantin were analyzed by mass spectrometry and NMR spectroscopy. The postulated lasso structure, which was assumed based on similarities of their primary structures with known lasso peptides, could be proven for both peptides. As the glucagon receptor antagonist BI-32169 differs from lasso peptides of class I and II, it can be considered as the first representative of the novel class III. The relaxed substrate specificity of the biosynthetic machinery of lasso peptides suggested their application as stable molecular scaffolds for the presentation of pharmacophors in order to combine their intrinsic stability with the function of bioactive epitopes. The conversion of the lasso peptide microcin J25 into a nanomolar inhibitor of avb3 and avb5 integrins with antiangiogenic activity by grafting of the integrin binding motif RGD onto the stable peptide framework demonstrates the so far unexplored pharmaceutical potential of lasso structured peptides. The results of this study provide significant insights into the structure, stability and biosynthesis of bacterial lasso peptides, which will improve genome mining for lasso structured peptides in the future and therefore contribute to the identification of novel, alternative peptide scaffolds for rational drug design.


* Das Dokument ist im Internet frei zugänglich - Hinweise zu den Nutzungsrechten