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Titel: Analyse der subzellulären Lokalisation des C-Signalvorläuferproteins p25 und die Identifikation der PopC-Spaltstelle in p25 in Myxococcus xanthus
Autor: Ammon, Meike
Weitere Beteiligte: Søgaard-Andersen, Lotte (Prof.)
Erscheinungsjahr: 2011
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2011/0078
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2011-00780
DOI: https://doi.org/10.17192/z2011.0078
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Analysis of the subcellular localization of the C-signal precursor p25 and identification of the PopC cleavage site in p25 in Myxococcus xanthus

Dokument

Schlagwörter:
Development, Fruchtkörperbildung, Myxococcus xanthus, C-Signal, Subtilase, Proteolyse, Serinproteinasen

Zusammenfassung:
Myxococcus xanthus ist ein Bakterium, das ein außergewöhnliches Verhalten bei Nährstoffmangel zeigt. Im Zuge eines Entwicklungszyklus bilden diese Bakterien Fruchtkörper, die mit Dauerformen, den sogenannten Myxosporen gefüllt sind, um die lebensbedrohlichen Umweltbedingungen zu überstehen. Sechs Stunden nach Eintritt des Hungerzustandes koordiniert und reguliert das C Signal die Aggregation der Zellen zur Fruchtkörperbildung, die Sporulation der Zellen zu Myxosporen und eine spezifische Genexpression. Beim C Signal handelt es sich um das 17 kDa große Protein p17, welches nach der Prozessierung des C Signalvorläuferproteins p25 durch die Subtilisin-ähnliche Serinprotease PopC entsteht. In dieser Arbeit sollte zum einen die Orientierung von p25 in der äußeren Membran untersucht und zum anderen die PopC-Spaltstelle in p25 identifiziert werden. Um die subzelluläre Lokalisation von p25 zu untersuchen, wurden intakte Zellen mit einer unspezifischen Protease behandelt. Anschließend wurde in Immunoblot Analysen geprüft, ob p25 im Vergleich zu Kontrollproteinen degradiert wird. p25 zeigte ein identisches Verhalten wie das Kontrollprotein PilQ, ein Protein der äußeren Membran, welches auf der Zelloberfläche exponiert ist. Als weitere Kontroll-proteine dienten Tgl, ein Protein der äußeren Membran, das ins Periplasma ragt, und PilC, ein Protein der inneren Membran. Tgl und PilC wurden im Gegensatz zu PilQ und p25 weniger stark degradiert. Daher deuten die Ergebnisse darauf hin, dass p25 auf der Zelloberfläche exponiert ist. Um die PopC-Spaltstelle zu identifizieren, wurden biochemische und genetische Strategien verfolgt. Synthetische Peptide wurden herangezogen, um die PopC-Spaltung zu analysieren. Der N-Terminus von p17 sollte mittels Massenspektrometrie bestimmt werden. Außerdem wurde die Spaltung von verkürzten MalE-p25 Deletionsderivaten und Alaninsubstitutionsmutanten durch gereinigtes PopC Protein in vitro untersucht. Damit wurde das Spaltmotiv in p25 auf die Aminosäuren 56LDV58 eingegrenzt. Die Untersuchungen von Alanin-substitutionen in vitro und in vivo lassen schlussfolgern, dass Aspartat 57 essentiell für die PopC-Spaltung in M. xanthus ist. Daher deuten die Daten darauf hin, dass PopC p25 im Spaltmotiv 56LDV58 nach Aspartat 57 spaltet.

Summary:
Myxococcus xanthus is a Gram-negative, rod-shaped δ-proteobacterium, which shows a complex developmental program. This program is initiated under starvation conditions and results in the formation of multicellular, spore-filled fruiting bodies. After six hours of starvation the C-signal coordinates and regulates the aggregation of cells into fruiting bodies, sporulation of cells into myxospores and a specific gene expression. The C-signal is a 17 kDa protein p17, which is generated by proteolytic cleavage of a 25 kDa precursor p25 by the subtilisin-like serine-protease PopC. The aim of this study was to investigate the subcellular localization of p25 in the outer membrane and to identify the PopC cleavage site in p25. To analyze the localization of p25, intact cells were treated with an unspecific protease. Immunoblot analysis with antibodies against p25 and against different control proteins were used to detect protein degradation. p25 was degraded like the outer membrane protein PilQ, which is exposed to the cell surface. Additionally, the outer membrane protein Tgl, which is exposed into the periplasmic space, and the inner membrane protein PilC were employed as controls. Tgl and PilC were degraded less drastically than PilQ and p25. These data suggest that p25 is exposed on the cell surface. To identify the PopC cleavage site, biochemical and genetic approaches were used. Synthetic peptides were explored to map the PopC cleavage site and the N-terminus of p17 was analyzed by mass-spectrometry. Truncated MalE-p25 derivatives as well as mutants containing alanine substitutions at certain amino acid positions were investigated after cleavage by purified PopC protein in vitro. With these experiments the PopC cleavage site was narrowed down to the amino acid motif 56LDV58 in p25. Furthermore, analysis of different alanine substitution mutants in vitro and in vivo revealed that aspartate in the position 57 of p25 is essential for PopC cleavage in M. xanthus. These data strongly suggest that PopC cleaves p25 after aspartate 57 in the cleavage motif 56LDV58.


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