Kultivierung von Denitrifikanten mit einem neuen nirK-Genotyp

Die Denitrifikation ist im Ökosystem von entscheidender Bedeutung. Besonders im Boden spielen Denitrifikanten durch die Remineralisierung von Nitrat zu molekularen Stickstoff eine entscheidende Rolle. Eines der Markergene der Denitrifikation ist nirK, welches für die kupfer-abhängige Nitrit-Reduktas...

Ausführliche Beschreibung

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Falk, Silke
Beteiligte: Conrad, Ralf (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2009
Biologie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Die Denitrifikation ist im Ökosystem von entscheidender Bedeutung. Besonders im Boden spielen Denitrifikanten durch die Remineralisierung von Nitrat zu molekularen Stickstoff eine entscheidende Rolle. Eines der Markergene der Denitrifikation ist nirK, welches für die kupfer-abhängige Nitrit-Reduktase kodiert. Denitrifikanten sind in ihrer Phylogenie sehr divers. Der Stammbaum von nirK beherbergt Cluster, die von nirK-Umweltsequenzen dominiert sind und keine nirK-Sequenz eines Isolates enthalten. Eines dieser Cluster ist Cluster I, welches im Fokus der vorliegenden Arbeit stand, da es von nirK-Sequenzen bislang unkultivierter Denitrifikanten aus Bodenproben dominiert wird. Mit einer Kultivierungsmethode die nicht spezifisch auf Denitrifikanten ausgerichtet war, sondern einen unspezifischen Ansatz verfolgte, sollte die Isolierung und Kultivierung nirK-enthaltender Organismen dieses Clusters aus Bodenproben ermöglicht werden. Als Probenmaterial dienten Lahn-Wiesenbodenproben. Vor der Kultivierung wurde durch die Erstellung einer nirK-Klonbibliothek die Verteilung der nirK-Sequenzen innerhalb des beprobten Lahn-Wiesenbodens analysiert. Mit der Ausnahme einer nirK-Klonsequenz waren alle nirK-Sequenzen auf die Cluster I und VI verteilt. Die aus Probenmaterial angesetzte Bodensuspension wurde vier Wochen unter oxischen Kultivierungsbedingungen, in Minimalmedium bei einer habitatspezifischen Inkubationstemperatur inkubiert. Acht nirK-enthaltende Isolate 187, 406, 467, 471, 469, 373, 484 und 205 wurden mit dieser Methode kultiviert. Die nirK-Sequenzen dreier Isolate gruppierte in das nirK-Cluster I, während die nirK-Sequenzen weiterer fünf Isolate eine phylogenetische Nähe zu den nirK-Sequenzen der Cluster II, V und VII zeigten. Mit unspezifischen Kultivierungsmethoden gelang es also Kulturen mit einem nirK-Genotyp des Clusters I zu kultivieren. Ferner zeigte sich, dass durch molekularbiologische, kultivierungs-unabhängige Methoden zum Teil andere nirK-Sequenzen nachgewiesen wurden als durch kultivierungs-abhängige Methoden. Phylogenetische Analysen der 16S rRNA-Gen-Sequenzen ergaben die Zuordnung der Isolate zu den Gattungen Bradyrhizobium (Isolat 406, 467, 469 und 471), Bosea (Isolat 187), Mesorhizobium (Isolat 373 und 484) und Devosia (Isolat 205). Die Isolate des nirK-Clusters I wurden hierbei alle als Spezies der Gattung Bradyrhizobium identifiziert. Auch die weiteren Gene der Denitrifikation nap/nar, nor und nos konnten für die Isolate der Gattungen Bradyrhizobium und Bosea nachgewiesen werden, mit Ausnahme des Isolates (471) der Gattung Bradyrhizobium das kein nosZ-Gen aufwies. Für die Isolate der Gattung Mesorhizobium wurden neben nirK die Denitrifikationsgene narG und cnorB bestimmt. Das Isolat 205 der Gattung Devosia wies neben nirK kein weiteres Gen der Denitrifikation auf. Ein phylogenetischer Vergleich der 16S rRNA-Gen-Phylogenie der Isolate mit den Phylogenien der funktionellen Gene nirK, norB und nosZ, zeigte eine Kongruenz der Stammbäume, wobei die nirK-Phylogenie die Gruppierungen am differenziertesten widerspiegelte. Aufgrund der großen phylogenetischen Nähe zwischen den nirK-Sequenzen der Isolate und den nirK-Umweltsequenzen des Clusters I kann man vermuten, dass es sich bei diesen Subcluster um eine Taxon-spezifische Gruppierung von Bradyrhizobium Spezies handelt. Trotz ihrer Identifizierung als Spezies der Gattung Bradyrhizobium wiesen die Isolate des nirK-Clusters I keine phylogenetische Nähe zur Spezies Bradyrhizobium japonicum auf, den einzigen bisher bekannten Denitrifikanten innerhalb dieser Gattung. Es lässt sich also vermuten, dass neben B. japonicum auch andere Bradyrhizobium Spezies in der Lage sind zu denitrifizieren. Die Isolate der Gattungen Bradyrhizobium und Bosea zeigten sowohl auf genomischer als auch auf funktioneller Ebene die Fähigkeit zur N2O-Produktion. Die Isolate der Gattung Mesorhizobium 373 und 484 wiesen zwar auf genomischer Ebene das Potential zur Denitrifikation auf, jedoch wurde auf funktioneller Ebene weder eine Umsetzung des NO3- zu N2O, noch ein Wachstum unter anoxischen Bedingungen mit NO3- als Elektronenakzeptor nachgewiesen. Die denitrifizierenden Spezies der Gattung Mesorhizobium wiesen keine phylogenetische Nähe zu den Isolaten der Gattung Mesorhizobium der vorliegenden Arbeit auf, so dass es sich bei den vorliegenden Isolaten möglicherweise um neue Spezies der Gattung Mesorhizobium handeln könnte. Für das Isolat 205 der Gattung Devosia konnte dem nirK-Gen keine Funktion zugeordnet werden. Durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit ist es möglich, dass bisher von unkultivierten Organismen aus Bodenhabitaten dominierte nirK-Cluster I näher zu charakterisieren.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2009.0782