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Zusammenfassung:
Der Calcium sensing Receptor (CaSR) ist ein gegenüber extrazellulärem Ca2+ sensibler G- Protein gekoppelter Rezeptor, der in allen für die Ca²+/Mg²+- Homöostase entscheidenden Organen des Körpers exprimiert wird. Der CaSR wird durch einen Konzentrationsanstieg von extrazellulärem Ca2+ aktiviert und initialisiert G-Protein vermittelt eine intrazelluläre second messenger Kaskade. Mit dieser intrazellulären Antwort greift der CaSR regulativ auf zwei Ebenen in die Ca²+/Mg²+- Homöostase ein. Erstens wird die Freisetzung von PTH gehemmt und die Sekretion von Calcitonin gefördert. Zweitens wird in der Niere die Rückresorption von Calcium aus dem Ultrafiltrat gehemmt. Wichtig ist in der Regulation der Ca²+/Mg²+- Homöostase durch den CaSR der Punkt (set point), d.h. die Konzentration an extrazellulären Agonisten, bei der die Aktivierung des CaSR einsetzt. Bei Dysfunktion des CaSR kommt die Regulation der Ca²+/Mg²+- Homöostase aus dem Gleichgewicht. Eine erhöhte Sensitivität des CaSR mit erniedrigtem set point führt zu einer Ca²+/Mg²+-Verlustsymptomatik, eine verminderte Sensitivität zu einer Hyperkalziämie. Heute weiß man, dass Mutationen im CaSR- Gen (CASR) zu Dysfunktionen des Rezeptors führen. Bekannt sind aktivierende Mutationen, die zu einer erhöhten Sensitivität des Rezeptors führen und inaktivierende Mutationen, welche mit einer erniedrigten Sensitivität des Rezeptors einhergehen. Drei Erkrankungen sind mit dem CaSR assoziiert, der Hypokalzämische Hypoparathyreoidismus , die Familiäre benigne hypokalziurische Hyperkalziämie und der Neonatale Hyperparathyreoidismus. Die vorliegende Arbeit setzt sich mit angeborenen Ca2+- und Mg2+-Verlusterkrankungen der Niere auseinander. In einem ersten Schritt wurden molekulargenetische Untersuchungen einer Patientengruppe durchgeführt, die alle unter renalen Ca²+/Mg²+-Verlusten litten. Die Patienten wurden aus einem Patientenkollektiv übernommen, bei denen sich der initiale Verdacht der Familiären Hypomagnesiämie mit Hyperkalziurie und Nephrokalzinose (FHHNC) nicht bestätigt hatte. Die Ursache der Ca²+/Mg²+- Verlustsymptomatik der Patienten war also unklar. In der Literatur beschriebene Zusammenhänge zwischen Mutationen im CaSR- Gen und Ca²+/Mg²+- Verlustsymptomen führten zu der Vermutung, dass die Ursache der Symptome in einer Dysfunktion des CaSR infolge einer aktivierenden Mutation liegen könnte. Ziel der Untersuchung war es also, eine aktivierende Mutation im CaSR- Gen dieser Patienten zu finden oder auszuschließen. Von besonderem Interesse schien hierbei die Frage, ob und wie aktivierende Mutationen die Ca²+/Mg²+- Homöostase beeinflussen. So befasst sich die Arbeit im zweiten Abschnitt, nach Anwendung von Mutagenese und der Messverfahren durch die Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp Methodik, mit der Beweisführung genotypischer Ursachen für die phänotypischen Symptome der CaSR assoziierten Erkrankungen. Dazu wählten wir aus der Literatur bekannte aktivierende (CaSR E127K, CaSR E127A, CaSR L125P) und inaktivierende (CaSR T138M) Mutationen aus, die mit Hilfe der Mutagenese in Xenopus laevis Oozyten transfiziert wurden. Die transfizierten Xenopus laevis Oozyten wurden nach einer Inkubationszeit steigenden extrazellulären Ca²+- Konzentrationen ausgesetzt und die Auswirkungen mit der Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Methode erfasst. Während der Messung wurde die Oozyte in der Messkammer ständig mit der jeweils benötigten Lösung umspült. Die Ca2+-Konzentration der CaCl2-Lösungen betrug anfänglich 0,5 mM und steigerte sich bis 10mM. Eine komplette Untersuchung für eine der jeweiligen Mutationen beinhaltete die Messung von mindestens sieben Oozyten in denen der jeweilig klonierte CaSR exprimiert war. Von den Versuchsergebnissen einer Messreihe wurden Mittelwerte bestimmt und statistischen ausgewertet. In der vorliegenden Arbeit konnten zwei Polymorphismen und eine relevante Mutation identifiziert werden. Die zwei unterschiedlichen Polymorphismen (CaSR G990R und CaSR A986S) wurden bei vier verschiedenen Patienten gefunden. Bei der entdeckten Mutation handelt es sich um eine heterozygote neu aufgetretene Substitutionsmutation (CaSR E127K). In der Auswertung der Ergebnisse der Messreihen durch die Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Methode konnten wir nachweisen, dass die von uns untersuchten aktivierenden Mutationen tatsächlich eine signifikant erhöhte Sensitivität gegenüber extrazellulärem Ca2+ im Vergleich zum Wildtyp hatten. Neben den drei aktivierenden Mutationen konnten wir auch bei der inaktivierenden Mutation CaSR T138M nachweisen, dass der so mutierte CaSR eine signifikant erniedrigte Sensitivität gegenüber extrazellulärem Ca2+ im Vergleich zum Wildtyp aufwies. Eine Dysfunktion der mutierten CaSR- Typen und damit eine krankheitsauslösende Bedeutung der Mutationen im CASR konnte somit nachgewiesen werden.

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