Die Rolle der Exocyst-Untereinheiten Sec6 und Sec8 im apikalen Transport der Saccharase-Isomaltase

Epithelzellen besitzen die Fähigkeit zur Ausbildung und Aufrechterhaltung funktional unterschiedlicher Bereiche der Plasmamembran. Die apikale Membran ist zum Lumen (Umwelt) gerichtet, die basolaterale Membran zur Basalmembran und zu den benachbarten Epithelzellen. Dabei unterscheiden sich die apika...

Ausführliche Beschreibung

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Wenzel, Patrick
Beteiligte: Jacob, Ralf (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2009
Klinische Zytobiologie und Zytopathologie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Epithelzellen besitzen die Fähigkeit zur Ausbildung und Aufrechterhaltung funktional unterschiedlicher Bereiche der Plasmamembran. Die apikale Membran ist zum Lumen (Umwelt) gerichtet, die basolaterale Membran zur Basalmembran und zu den benachbarten Epithelzellen. Dabei unterscheiden sich die apikale und die basolaterale Membran in ihrer Protein- und Lipidzusammensetzung. Diese unterschiedlich aufgebauten Bereiche der Plasmamembran werden durch die Tight Junctions voneinander getrennt und durch einen selektiven Transport aufrechterhalten. Für den selektiven Transport spielen verschiedene Sortiersignale eine entscheidende Rolle, die die Proteine in entsprechende Transportvesikel sortieren. Im basolateralen Transport sind es vor allem spezifische Aminosäuresequenzen im zytoplasmatisch gelegenen Anteil der Proteine. Apikale Sortiersignale sind vielfältiger und umfassen N- und O-Glykane, GPI-Anker und Transmembrandomänen. Diese apikalen Sortiersignale beeinflussen, ob apikal-lokalisierte und -sezernierte Proteine einen Lipid Raft-abhängigen oder einen Lipid Raft-unabhängigen Weg zur apikalen Membran durchlaufen. Als Lipid Rafts werden spezielle Membranmikrodomänen in Zellmembranen angesehen. Auf den Weg gebrachte Transportvesikel mit der zuvor selektiv zusammengestellten Fracht, binden zunächst an die Zielmembran, bevor sie mit dieser verschmelzen. Diese Bindung wird von Vesikel-Bindungskomplexen vermittelt. Einer dieser Bindungskomplexe ist der Exocyst-Komplex, ein Multiproteinkomplex bestehend aus acht Untereinheiten. Exocyst-Untereinheiten befinden sich dabei sowohl am Transportvesikel (Ligand) als auch an der Zielmembran (Rezeptor). Ligand und Rezeptor vermitteln die spezifische Bindung, bevor die Verschmelzung stattfinden kann. Die Verschmelzung von Vesikel und Membran wird über sog. SNARE-Komplexe vermittelt. In polaren MDCK-Zellen (Nierenepithelzellen) befindet sich der überwiegende Teil des Exocyst-Komplexes an der lateralen Membran, in unmittelbarer Nähe zu den Tight Junctions. Eine wichtige Rolle des Exocyst-Komplexes im gerichteten Transport konnte für einige basolateral lokalisierte Proteine in MDCK-Zellen bereits gezeigt werden. Im Rahmen dieser Dissertation, wurde die Rolle bestimmter Exocyst-Untereinheiten, besonders von Sec8, im apikalen Transport des Modellproteins Saccharase-Isomaltase (SI) in MDCK-Zellen untersucht. Ausgangspunkt war die Identifizierung der Untereinheit Sec6 an SI-tragenden, apikalen Transportvesikeln 20 min nach Verlassen des trans-Golgi Netzwerkes (TGNs) in polaren MDCK-SI-YFP-Zellen. Immunpräzipitations-Experimente konnten die Assoziation einer weiteren Exocyst-Untereinheit, Sec8, mit SI-tragenden Vesikeln zeigen. Dabei interagiert Sec8 indirekt mit SI. Eine Verminderung der endogenen Sec8-Konzentration durch spezifische siRNA zeigte keinen Einfluss auf den apikalen Transport der SI in MDCK-SI-Zellen. Mikroskopische Untersuchungen an MDCK-SI-YFP-Zellen lassen auf eine Interaktion von Sec6 und Sec8 mit SI-tragenden Vesikeln an der lateralen Membran schließen. Dieser Membranbereich entspricht der Hauptlokalisation des Exocyst-Komplexes in polaren MDCK-Zellen und befindet sich in unmittelbarer Nähe der Tight Junctions. Mikroskopische Untersuchungen an unpolaren COS-Zellen (Fibroblasten) konnten keine Kolokalisation von SI-tragenden Vesikeln mit den Exocyst-Untereinheiten Sec6 und Sec8 zeigen. Sec6 und Sec8 sind in COS-Zellen überwiegend an Recycling Endosomes lokalisiert. Die SI wird über einen Lipid Raft-abhängigen Weg zur apikalen Membran transportiert. Eine Isolation dieser speziellen Membranmikrodomänen ergab, dass die Untereinheit Sec8 ebenfalls mit sog. Detergenz-resistenten Membranen (DRMs) aus MDCK-SI-Zellen assoziiert ist. Die im Rahmen der Doktorarbeit gewonnenen Daten deuten darauf hin, dass die Exocyst-Untereinheit Sec8 keinen Einfluss auf den apikalen Transport der SI an die Zelloberfläche in MDCK-Zellen hat. Zu diesem Zeitpunkt kann keine Aussage darüber getroffen werden, wo die Assoziation von Sec8 mit DRMs zustande kommt. Weitere Untersuchungen sind dafür notwendig.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2009.0470