Untersuchung von p38α MAP-Kinase/Inhibitor-Komplexen in Lösung mittels Kernresonanzspektroskopie

Zur Entwicklung potentieller Arzneistoffe ist eine genaue Kenntnis des Bindungsverhaltens eines Inhibitors im Zielprotein notwendig. Einige Proteine lassen sich im Komplex mit potentiellen Inhibitoren kristallisieren und deren Bindungsweise erforschen. In Lösung dagegen findet man das Protein eher...

Ausführliche Beschreibung

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Honndorf, Valerie Simone
Beteiligte: Klebe, Gerhard (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2008
Pharmazeutische Chemie
Schlagworte:
p38
RDC
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Zur Entwicklung potentieller Arzneistoffe ist eine genaue Kenntnis des Bindungsverhaltens eines Inhibitors im Zielprotein notwendig. Einige Proteine lassen sich im Komplex mit potentiellen Inhibitoren kristallisieren und deren Bindungsweise erforschen. In Lösung dagegen findet man das Protein eher in seinem natürlichen dynamischen Verhalten als im Kristall, so dass eine Strukturlösung eines Protein-Inhibitor-Komplexes mittels NMR nicht nur einen Aufschluss über die Struktur gibt, sondern auch über die Änderung des dynamischen Verhaltens im Vergleich zu freiem Protein in Lösung. p38α MAP-Kinase spielt eine wichtige Rolle in den Wechselwegen, die für die Stressantwort der Zelle zuständig sind, und ist ein wichtiges Zielprotein in der Entwicklung von Inhibitoren, die bei der Behandlung von Krebs, Entzündungen und Autoimmunkrankheiten eingesetzt werden. Aus diesem Grund wurde die Struktur und das dynamische Verhalten des Proteins im Komplex mit zwei verschiedenen Inhibitoren untersucht. SB203580 ist der Prototyp der p38α-Inhibitoren und NR243 gehört zu einer neuen Gruppe hochselektiver Inhibitoren, der von der Gruppe von Prof. Laufer an der Universität Tübingen synthetisiert und zur Verfügung gestellt wurde. Durch eine Vielzahl an alpha-Helices im Carboxy-Terminus des Proteins, deren Aminosäuren in 2D HSQC-Spektren ähnliche chemische Verschiebungen aufweisen, kommt es zu Überlagerungen, so dass eine Zuordnung dieser Resonanzen erschwert wird. Deshalb wurde die Methode der selektiven Markierung angewendet. Auf diese Weise konnten zwischen 60% (bei den p38α-Inhibitor-Komplexen) und 71% (bei freiem p38α) der Rückgratresonanzen der Aminosäuren im Protein zugeordnet werden. Desweiteren wurden Messungen residualer dipolarer Kopplungen des freien und Inhibitor-gebundenen Proteins durchgeführt und im Vergleich mit der Kristallstruktur des freien Proteins festgestellt, dass neben der Übereinstimmung der globalen Struktur in Lösung und im Kristall die Hinge Region, die den Amino- und Carboxy-Terminus von p38α verbindet, in Lösung anders als im Kristall des freien Proteins vorliegt. Sie nimmt eine Konformation ein, die nur in Kristallstrukturen von Komplexformen der Kinase mit Quinazolinon- bzw. Pyridol-Pyrimidin-Inhibitoren beobachtet wird. Die Aufnahme intermolekularer Kern-Overhauser-Effekt-Wechselwirkungen (NOESY-Spektren) von selektiv markierten Protein-Inhibitor-Komplexproben sollte es ermöglichen, ohne eine Seitenkettenzuordnung die Komplexstrukturen aufzuklären, wobei die Kristallstruktur des p38α/SB203580-Komplexes als Kontrolle verwendet wurde. Die Messung von intermolekularen NOE-Wechselwirkungen von selektiv protonierten Aminosäuren des Proteins zu Inhibitorprotonen erwies sich als erfolgreich, was die Auswertungen von NOESY-Spektren des p38α/SB203580-Komplexes bei Markierung von Leucin, Threonin oder Tyrosin im Protein beweisen. Die NOE-Signale bestätigen einerseits, dass die Position des Inhibitors in der Bindetasche im Einklang mit der Kristallstruktur steht, andererseits kann man aber anhand der TROSY-HSQC-Spektren und RDC-Daten von einer Ansammlung verschiedener ähnlicher Komplexstrukturen aufgrund der Beweglichkeit des Proteins sprechen, wovon die Kristallstruktur nur eine Konformation widerspiegelt. Mit Hilfe eines Intensitätenvergleichs von intramolekularen zu intermolekularen NOE-Signalen, konnten obere Distanzeinschränkungen der entsprechenden Inhibitorprotonen zu den Methylprotonen der Seitenketten bestimmt werden. Diese Distanzen und die Bestimmung der mit dem Inhibitor wechselwirkenden Aminosäuren durch das Ausschlussprinzip, ermöglichte die Modellierung des p38α/NR243-Komplexes mit HADDOCK, die ein eindeutiges Ergebnis lieferte. Es ist also möglich, ohne eine Kristallstruktur oder eine vollständige Resonanzzuordnung eines Proteins auf die in dieser Arbeit beschriebene Weise eine Protein-Inhibitor-Struktur zu lösen. Das Verfahren ist eine Alternative zur Kristallographie und ist für die Strukturbetimmung innerhalb kurzer Zeit oder für das Screening von Inhibitoren verwendbar.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2008.0753