Neue chromogene Screening-Methoden der Fibrinolyse Diagnostik

5.1. Fibrinolysis Parameters Assay (FIPA) Mit dem FIPA ist ein Globaltest der Fibrinolyse-Diagnostik entwickelt worden. Er ist ein einfacher, schneller und wirtschaftlicher Routine-Test für klinisch relevante plasmatische Fibrinolyse Parameter wie Plasminogen, Plasminogen Aktivator Inhibitor Typ 1...

Ausführliche Beschreibung

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Baumeister, Frauke
Beteiligte: Stief, Thomas, (Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2008
Medizin
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:5.1. Fibrinolysis Parameters Assay (FIPA) Mit dem FIPA ist ein Globaltest der Fibrinolyse-Diagnostik entwickelt worden. Er ist ein einfacher, schneller und wirtschaftlicher Routine-Test für klinisch relevante plasmatische Fibrinolyse Parameter wie Plasminogen, Plasminogen Aktivator Inhibitor Typ 1 (PAI-1) und 2-Antiplasmin. Die Wirkung von Aprotinin kann unter anderem mit dem FIPA beurteilt werden. Allerdings ist er nicht sensitiv für physiologische Konzentrationen an Prourokinase (scu-PA) oder Gewebe Plasminogenaktivator (t-PA). Als optimaler Testaufbau stellten sich folgende Konzentrationen heraus: 50 µl Citratplasma werden mit 50 µl Urokinase-Reagenz bestehend aus 10 IU u-PA/ml, 1,1 mmol/l Tranexamsäure, 1%Polygelin, 0,1% Triton X 100 , PBS, pH 7,4 für 20 Minuten bei 37°C inkubiert, die so genannte Plasmin Erzeugungsphase. Anschließend werden für die Plasmin Bestimmungsphase 50 µl einer 3 mmol/l H-D-Val-Leu-Lys-pNA, 1,05 mol/l KCl Substratlösung hinzugefügt. Die lineare Kinetik wird mittels eines Mikrotiterplatten Fotometers bei 405 nm durch die Differenzbildung zwischen dem freigesetzten pNA und dem Orginalsubstrat bestimmt. Die Ergebnisse werden gegen ein gepooltes Normalserum (100% FIPA-Aktivität) kalibriert. Die intra- und interassay-Variationskoeffizienten liegen bei < 5%. Die untere Nachweisgrenze des funktionellen Fibrinolyse Test ergibt 5% der Aktivität des Kontrollplasmas. Die normale FIPA-Aktivität beträgt 100%, = 25%. Die FIPA Aktivität korreliert negativ (r = - 0,684) mit der Aktivität des Plasminogenaktivator-Inhibitor Typ 1 (PAI-1) von Patienten-Proben. 5.2. Activated Fibrinolysis Parameters Assay (AFIPA) Neben dem FIPA ist mit dem AFIPA ein weiterer Globaltest der Fibrinolyse-Diagnostik entwickelt worden. Durch sein Testprinzip basierend auf der physiologischen Kontaktaktivierung der Fibrinolyse ist er sensitiv auch für scu-PA. Der AFIPA wird folgendermaßen durchgeführt: 50 µl Plasma mit 100 mM Arginin pH 8,7 stabilisiert und 25 µl 50 mM Chloramin T in 100 mM NaHCO3; pH 8,0 bei 37°C 5 Minuten inkubiert. Anschließend werden 150 µl 0.1 g/l Ellagsäure hinzupipettiert und 120 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach der zweiten Inkubation werden 25 µl 6,0 mM chromogenes Substrat H-D-Val-Leu-Lys-pNA in 3,5 M KCl zugegeben und die lineare Kinetik ( A405nm/min) wird nach 0 und 30 Minuten bei einer Absorption von 405 nm durch ein Mikrotiterplatten-Fotometer gemessen. Die intra- und interassay-Variationskoeffizienten liegen bei < 5%. Es konnte eine nahezu lineare Plasminaktivität nachgewiesen werden mit einer Wiederfindung von 90%. 5.3. Plasmatischer PAI-2 Test Durch den neu entwickelten plasmatischen PAI-2 Test kann die PAI-2 Aktivität im Blut bestimmt werden. PAI-2 ist ein Marker der Plazentafunktion und hat klinische Relevanz bei der Beurteilung von normaler Schwangerschaft und Plazentainsuffizienz, wie zum Beispiel bei der Präeklampsie. PAI-2 besitzt eine langsamere Reaktionskinetik als PAI-1. Nachdem die PAI-1/u-PA-Reaktion nach 5 Minuten bei 37°C komplett abgeschlossen ist, kann die PAI-2 Aktivität durch die Bestimmung der Differenz in der u-PA Inhibition zwischen 35 Minuten und 5 Minuten Inkubationszeit errechnet werden. PAI-2 im Plasma von Schwangeren wird im PAI-2 Test folgendermaßen bestimmt: 25 µl Plasma werden mit 25 µl 40 IU/ml Urokinase (u-PA) pH 8,4 in 100 mM Tris, 0,1% Triton X 100 , 1% Polygelin, Aqua dest. (Testpuffer) für 5 Minuten oder für 35 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend werden 25 µl 40 mM Chloramin T und 25 µl 0,4 g/l (4,34 µM) Glu-Plasminogen in Testpuffer mit 60 mM Tranexamsäure zugefügt. Nach 5 Minuten bei 37°C werden 50 µl 1,8 mM H-D-Val-Leu-Lys-pNA in 1,39 M KCl zugegeben, und die lineare Kinetik ( A405nm/min) wird bei einer Absorption von 405 nm durch ein Mikrotiterplatten-Fotometer gemessen. Die Differenz der Inhibierung zwischen 35 Minuten und 5 Minuten wird zur Bestimmung der PAI-2 Aktivitäten berechnet. Die PAI-2 Tests werden nicht beeinflusst durch therapeutische Heparin Plasmakonzentrationen. Die intra- und interassay-Variationskoeffizienten liegen bei < 5%, die untere Nachweisgrenze liegt bei 2 U/ml PAI-2 und die Wiederfindung bei 95 7%. Eine negative Linearität besteht zwischen PAI-2 und Extinktion. Die PAI-2 Aktivität von Schwangeren beträgt 30,3 19,9 U/ml. Die plasmatische PAI-2 Aktivität korreliert mit der PAI-1 Aktivität negativ (r = - 0,730). Zusammengenommen werden in der vorliegenden Arbeit drei neue chromogene Fibrinolyseteste erforscht. Insbesondere der Globaltest FIPA, aber auch AFIPA und PAI-2 Test sind wertvolle neue Techniken, um den Fibrinolyse-Status von Patienten zu bestimmen.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2008.0719