Charakterisierung und Struktur einer Hydroxy(phenyl)pyruvat Reduktase aus Coleus blumei

Das heterolog exprimierte Protein einer in der vorangegangenen Doktorarbeit von Dr. K. H. Kim als Hydroxyphenylpyruvat Reduktase (HPPR) isolierten cDNA-Sequenz aus Suspensionkulturen von Coleus blumei wurde in dieser Arbeit charakterisiert und zwei Kristallstrukturen erstellt. Das Enzym HPPR kat...

Ausführliche Beschreibung

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Janiak, Verena
Beteiligte: Petersen, Maike (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2007
Pharmazeutische Biologie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Das heterolog exprimierte Protein einer in der vorangegangenen Doktorarbeit von Dr. K. H. Kim als Hydroxyphenylpyruvat Reduktase (HPPR) isolierten cDNA-Sequenz aus Suspensionkulturen von Coleus blumei wurde in dieser Arbeit charakterisiert und zwei Kristallstrukturen erstellt. Das Enzym HPPR katalysiert die Reduktion von Hydroxyphenylpyruvaten zu den entsprechenden Laktaten und soll an der Biosynthese von Rosmarinsäure in Pflanzen beteiligt sein. Nach Klonieren der putativen H(P)PR cDNA, konnte das Enzym in Bakterien exprimiert und über den durch die Expression angehängten His-Tag aufgereinigt werden. Eine Charakterisierung des Enzyms zeigte abweichende Werte zur nativen HPPR, mit einem höheren Temperaturoptimum, abweichenden Werten bei den Km-Werten für die Cosubstrate NADH und NADPH und vor allem Unterschieden in der Substratspezifität. Während für das native Enzym 4-Hydroxyphenylpyruvat (pHPP) als das natürliche Substrat mit einem apparenten Km-Wert von 10 bzw. 80 µM bestimmt wurde, lag für das gleiche Substrat bei der heterolog exprimierten H(P)PR der apparente Km-Wert mit 16,6 mM deutlich höher. Dabei sei vermerkt, dass bei der Bestimmung einiger Substrate Probleme bei der Messbarkeit auftraten und daher der Sättigungsbereich mit pHPP als Substrat nicht erreicht wurde. Weiterhin konnten Substrate identifiziert werden, die wesentlich besser umgesetzt wurden. So wurde der apparente Km-Wert von Hydroxypyruvat mit ca. 1 mM bei starker Substrathemmung und der von Glyoxylat mit 2 mM bestimmt. Eine Mutation der H(P)PR-cDNA konnte durch Klonierung und Sequenzierung der H(P)PR aus zwei Coleus blumei Pflanzen ausgeschlossen werden. Das Vorkommen sehr ähnlicher Enzyme in anderen Pflanzen, die keine Rosmarinsäure bilden, verstärkte die Vermutung, dass dem klonierten Enzym möglicherweise eine andere Hauptfunktion in vivo zukam. Bei der Suche nach verwandten Enzymen in anderen Pflanzen konnten zwei neue Sequenzen aus Paprika und Aubergine aus der Familie der Solanaceae mit einer Identität zu dem klonierten Enzym auf Aminosäure-Ebene von 83,1% bzw. 83,4% isoliert werden. Neben der Enzymcharakterisierung wurde die klonierte H(P)PR kristallisiert und sowohl eine native Struktur als auch eine NADP+-Komplextruktur bestimmt. Die Struktur weist den allgemeinen Aufbau der D-Isomer-spezifischen 2-Hydroxysäure Dehydrogenase Enzym-familie auf. Das Protein bildet zwei Domänen: Die kleinere der beiden Domänen ist für die Substratbindung verantwortlich, während die andere das Cosubstrat bindet. Zwischen den beiden Domänen liegt das katalytische Zentrum. Von verwandten Enzymen ist bekannt, dass die Domänen unterschiedliche Bindungswinkel annehmen, je nach Bindung von Substrat und Cosubstrat. Für die beiden H(P)PR-Strukturen konnte kein signifikanter Unterschied im Bindungswinkel festgestellt werden. Ein Vergleich der H(P)PR-Struktur mit anderen Kristallstrukturen zeigte trotz sehr geringer Identitäten auf Nukleotid- und Aminosäureebene eine hohe Ähnlichkeit zu einer bakteriellen D-Glycerat Dehydrogenase und einer menschlichen Glycerat Dehydrogenase/Hydroxypyruvat Reduktase. Dies könnte ein Hinweis auf die eigentliche Funktion des heterolog exprimierten Enzyms sein. Da es nicht gelungen war, pHPP im Enzym mitzukristallisieren, wurden computersimulierte Docking-Versuche durchgeführt. Dabei schien für Substrate mit Phenylring keine eindeutige Bindung vorhersagbar zu sein, während für kleinere Substrate eine eindeutigere Lösung angezeigt wurde. Diese gefundene Lösung entspräche einem Bindungsmodus, der bereits für andere Proteine vorhergesagt wurde. Die Ergebnisse aus den enzymatischen Untersuchungen und auch die Auswertung der Kristallstrukturen deuten auf eine andere Hauptfunktion des klonierten Enzymes hin, obwohl die Beteiligung an der Rosmarinsäure-Biosynthese als weitere Reaktion nicht ausgeschlossen ist. Eine mögliche Funktion könnte eine Beteiligung an der Photorespiration sein, was das Vorkommen verwandter Enzyme in anderen, nicht Rosmarinsäure-haltigen Pflanzen erklären würde. Aus unterschiedlichen Pflanzen wurde eine Hydroxypyruvat Reduktase (HPR-2) beschrieben, die im Cytosol vorkommt, NADPH als Cofaktor benutzt und Hydroxypyruvat zu D-Glyoxylat reduziert. Von der HPR-2 sind bislang noch keine Sequenzen und auch keine Kristallstrukturen bekannt. Gegen diese Therorie spräche allerdings, dass die für dieses Enzym codierende mRNA aus Dunkel-Zellkulturen von C. blumei isoliert wurde. Im Dunklen sollte keine Photorespiration stattfinden und die an diesem Prozess beteiligten Enzyme sollten demnach auch nicht exprimiert werden. Weitere Untersuchungen müssten durchgeführt werden, um die Funktion des klonierten Enzyms eindeutig zu klären, aber erste Hinweise deuten auf eine mögliche Funktion des klonierten Enzyms als HPR-2.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2008.0121