CIS-acting elements controlling the expression of the human GLI3 gene

Die Entwicklung der Gliedmaßen ist ein komplexer Vorgang, der zahlreiche molekulare Faktoren und Signalwege involviert. Diese dirigieren während der Embryogenese die Umwandlung der Gliedmaßenknospe zu den fertigen Extremitäten. Die antero-posteriore Musterbildung wird vom Signalmolekül „sonic hedgeh...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Paparidis, Zissis
Beteiligte: Renkawitz-Pohl, Renate (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Englisch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2005
Humangenetik
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Beschreibung
Zusammenfassung:Die Entwicklung der Gliedmaßen ist ein komplexer Vorgang, der zahlreiche molekulare Faktoren und Signalwege involviert. Diese dirigieren während der Embryogenese die Umwandlung der Gliedmaßenknospe zu den fertigen Extremitäten. Die antero-posteriore Musterbildung wird vom Signalmolekül „sonic hedgehog“ gesteuert, das über die GLI-Transkriptionsfaktoren die Transkriptionsaktivität von Zielgenen reguliert. Zeit, Lokalisierung und Menge der GLI-Transkription sind von kritischer Bedeutung. Mutationen, die das Vorhandensein der notwendigen Menge dieser Faktoren in den Zellen beeinflussen oder ihre Funktion stören, können in den Gliedmaßenknospen zu Wachstumsdefekten und andernorts zur Krebsentstehung führen. Um einen Beitrag zum Nachweis und zur funktionellen Charakterisierung von cis-regulatorischen Elementen von GLI3 und deren potentieller Bedeutung für die Pathogenität zu liefern, wurden in dieser Dissertation drei Fragen bearbeitet: · Wie wird die Expression von humanem GLI3 reguliert? · Besitzen GLI2 und GLI3 ähnliche regulatorische Elemente? · Sind Mutationen in regulatorischen Elementen von GLI3 an der Pathogenität involviert? Um letzteres vorzubereiten wurden 24 Patienten mit Gliedmaßendefekten, die als potentielle GLI3-Morphopathien klassifiziert waren, auf Punktmutationen hin untersucht. 20 Fälle, bei denen keine Mutation in der kodierenden Sequenz gefunden werden konnte, sind Kandidaten für eine Mutationssuche in cis-regulatorischen Elementen. An der Kontrolle der Transkription des GLI3-Gens sind die Promoterregion und andere cis-aktive Sequenzen, wie Enhancer, beteiligt. Ein minimaler Promotor wurde definiert und funktionell getestet. Zwei Initiationsstellen der Transkription wurden mit cDNA aus Plazenta und Skelettmuskeln identifiziert. Durch Mutagenese wurden Sequenzelemente, die an der Kontrolle der GLI3-Expression beteiligt sind, eingegrenzt. Funktionelle Studien an transgenen Mäusen hatten gezeigt, dass die Expressionsdomänen von GLI2 und GLI3 in großen Bereichen überlappen. Die transkribierte Region von GLI2 wurde im 5’-Bereich gegenüber der bekannten cDNA um 1 kb nicht kodierender DNA ausgedehnt. Trotzdem konnten Sequenzvergleiche zwischen Mensch und Maus keine Homologie zwischen regulatorischen Elementen von GLI2 oder GLI3 entdecken. Die genomische Sequenz von GLI3 wurde für evolutionäre Vergleiche benutzt, um nach hochkonservierten, nicht-kodierenden Elementen zu suchen, die eventuell cis-regulatorische Elemente repräsentieren. Drei so entdeckte potentielle Enhancerelemente wurden in transient transfizierten Zellen daraufhin untersucht, ob sie die Transkription eines Reportergens unter der Kontrolle des minimalen GLI3-Promoters steuern konnten. Durch Mutagenese vorhergesagter Bindungssequenzen für Transkriptionsfaktoren und nachfolgende Analyse der regulatorischen Kapazität der Elemente in zellulären Reportergentests wurden funktionell besonders bedeutsame Stellen definiert. An diese Bereiche bindende Transkriptionsfaktoren, die in die Regulation von GLI3 involviert sein könnten, wie NFATp, müssen noch bestätigt werden. Die drei Elemente wurden ebenfalls auf ihre Fähigkeit hin untersucht, in transgenen Mäusen ein Reportergen zu aktivieren. In transgenen Mausembryonen konnte beobachtet werden, dass eines der potentiellen Enhancerelemente ein Expressionsmuster steuerte, das zeitlich und räumlich einem Teil des endogenen Maus-GLI3-Musters entsprach, vor allem im Gehirn, den Mandibeln, im Nasenbereich und im Herzen. Die erzielten Ergebnisse tragen zum Verständnis der räumlichen und zeitlichen Expressionskontrolle von GLI3 bei, dem Schlüsselfaktor der „sonic hedgehog“- Signalkaskade, und verschaffen einen Einblick in die potentielle Rolle hochkonservierter, nicht-kodierender Sequenzelemente im menschlichen Genom.