Untersuchung zur Beteiligung von Proteinkinase A und Tyrosinkinasen an der Calcium-abhängigen Signaltransduktion von Glucagon-like Peptide 1(7-36)amid in Insulin-sezernierenden Zellen des endokrinen Pankreas

Glucagon-like Peptide-1(7-37)/(7-36)amid, GLP-1, ist ein insulinotropes intestinales Peptid-Hormon, das vor allem wegen der Verstärkung der Glukose-abhängigen Insulinsekretion, ein großes Potential bei der Therapie des Diabetes mellitus hat. Die Signaltransduktion von GLP-1 ist in weiten Teilen noch...

Ausführliche Beschreibung

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Moormann, Birgit
Beteiligte: Bode, Hans-Peter (Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2005
Pharmakologie und Toxikologie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Glucagon-like Peptide-1(7-37)/(7-36)amid, GLP-1, ist ein insulinotropes intestinales Peptid-Hormon, das vor allem wegen der Verstärkung der Glukose-abhängigen Insulinsekretion, ein großes Potential bei der Therapie des Diabetes mellitus hat. Die Signaltransduktion von GLP-1 ist in weiten Teilen noch nicht geklärt. Bisherige Studien ergaben, dass GLP-1 an den G-Protein-gekoppelten GLP-1-Rezeptor bindet. Über Aktivierung der Adenylatzyklase erhöht sich der cAMP-Spiegel. Letztlich kommt es durch unbekannte Schritte zu einem Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration und zu einer erhöhten Insulinsekretion. Oftmals sind bei der Signaltransduktion Proteinkinasen wie die cAMP-abhängige Proteinkinase A oder Tyrosinkinasen beteiligt, so dass dies auch bei der GLP-1-induzierten Calciumerhöhung und Insulinsekretion vermutet wurde. Bisherige Arbeiten wurden oft ungeeignete ß-Zellmodelle ausgeführt, verwendet zum Beispiel nur ein Proteinkinase A-Hemmstoff und kamen so zu unterschiedlichen Ergebnissen über die Bedeutung von Proteinkinasen bei der Signaltransduktion von GLP-1. Ziel dieser Arbeit war es, die Beteiligung von Proteinkinase A und Tyrosinkinasen an der Calcium-abhängigen Signaltransduktion von Glucagon-like Peptide 1(7-36)amid in Insulin-sezernierenden Zellen des endokrinen Pankreas zu untersuchen. Dazu wurde 1.) eines geeigneten ß-Zellmodell, hier die Glukose-sensible INS-1-Zellen sowie ß-Zellen in präparierten Langerhanssche Inseln der Maus, und 2.) verschiedene, angemessene Proteinkinasehemmstoffe verwendet. Mit den Fluoreszenzfarbstoffen Fura-2 bzw. Bisoxonol wurden die intrazelluläre Calciumkonzentrationen an beiden Zelltypen sowie Veränderungen im Membranpotential der INS-1-Zellen gemessen. Um Artefakte am Rezeptor auszuschließen, wurde neben GLP-1 durch Forskolin die Adenylatzyklase direkt aktiviert. Weder durch den selektiven Proteinkinase A-Hemmstoff KT5720 (bis zu 20µM) noch Rp-cAMPs (bis 1mM) konnte eine Hemmung der GLP-1- oder Forskolin-Wirkung erzielt werden. Der dritte Proteinkinase A-Inhibitor H-89 selbst führte konzentrationsabhängig (bis 40µM) zu einer deutlichen Reduktion der Glukose-induzierten Effekte, wie den Calciumanstieg oder den Calciumoszillationen der Langerhansschen Inseln. Erst durch lange Inkubationszeiten mit deutlich höheren als sonst verwendeten Konzentrationen ließen sich die GLP-1 bzw. Forskolin-induzierte Erhöhung des Calciumspiegels sowie die Membrandepolarisation leicht reduzieren, so dass es sich dabei eher um einen sekundären Effekt infolge des verminderten Glukoseeinflusses zu handeln scheint. Insgesamt zeigte die fehlende Inhibition durch die drei Hemmstoffe, dass die Proteinkinase A an der Signaltransduktion von GLP-1 bzw. Forskolin zur Erhöhung des intrazellulären Calciumspiegels nicht beteiligt ist. Die Tyrosinkinase-Hemmstoffe Genistein (bis 100µM) und Herbimycin A (bis 20µM) führten beide, Genistein mehr als Herbimycin A, zu konzentrationsabhängigen, massiven Veränderungen der Glukose-abhängigen Calciumerhöhung sowie der Calciumoszillationen. Die Ursache hierfür, ob es sich dabei zum Beispiel um eine spezifische Tyrosinkinase-Hemmung oder vielleicht einen unspezifischen toxischen Effekt handelt, werden in der Literatur kontrovers diskutiert. In Relation zu diesen starken Veränderungen der Glukosewirkung ließ sich bei keinem der beiden Hemmstoffe eine isolierte Inhibition des GLP-1 oder Forskolin-Effektes zeigen. Auch der potente, unspezifische Proteinkinasehemmstoff Staurosporin bei relevanter Dosierung zeigte keine Beeinflussung der durch GLP-1 und Forskolin bedingten Calciumerhöhung sowie der Membrandepolarisation. Insgesamt zeigt dies Arbeit, dass für den GLP-1-induzierten Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration und der Membrandepolarisation weder Proteinkinase A noch Tyrosinkinasen, eher sogar keine Proteinkinase eine entscheidende Rolle spielt. An der möglichen Signaltransduktion dieser GLP-1-Effekte könnten ein nicht selektiver Kationenkanal über cAMP alleinig (NSCC) oder in Kombination mit einer Hyperpolarisation (HCN) ebenso wie der cAMP-regulierte Ras Guanin-Nucleotid-Austausch-Faktor, Epac, beteiligt sein. Um den genauen Mechanismus, unter anderem welche Ionenkanäle beeinflusst werden, aufzuschlüsseln, sind weitere Untersuchungen notwendig. Zudem ist zu erwähnen, dass in der Literatur ebenfalls ein Calcium-unabhängiger Anteile der GLP-1-induzierten Insulinsekretion beschrieben ist. So ist eine Beteiligung von Proteinkinasen distal der Calciumerhöhung, zum Beispiel durch Vergrößerung des Reservepools der Insulingranula oder einer Tyrosinkinase-abhängig verstärkter Exozytose, durchaus mit den Ergebnissen dieser Arbeit vereinbar.