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Titel:Untersuchungen zur Funktion endothelialer Transkriptionsfaktoren bei der Angiogenese
Autor:Licht, Alexander H.
Weitere Beteiligte: Clauss, Matthias (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr:2005
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2005/0021
DOI: https://doi.org/10.17192/z2005.0021
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2005-00216
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):The role of endothelial transcription factors for angiogenesis

Dokument

Schlagwörter:
Endothelium, Hypoxie, Transcription factor, Angiogenesis, Angiogenese, Embryonic development, Hypoxia, Transkriptionsfaktor, Embryonalentwicklung, Endothel

Zusammenfassung:
Mit Hilfe des Cre-loxP Rekombinationssystems können Gene zelltypspezifisch inaktiviert werden. Hier wurden die genregulatorischen Elemente des flk-1 Gens mit dem Cre Rekombinase Gen fusioniert und transgene Mauslinien etabliert (flk-1-Cre). Diese Mäuse wurden mit der Reportermauslinie Rosa26R gekreuzt, so dass in doppelt transgenen Nachkommen die Cre Aktivität durch LacZ-Färbung analysiert werden konnte. Die Untersuchung von flk-1-Cre/ Rosa26R Embryonen und adulten Tieren zeigte eine spezifische Färbung der Endothelzellen von Blutgefäßen in fast allen Organsystemen. Außerdem wurde die Cre Expression in Gefäßen von experimentellen BFS-1 Tumoren nachgewiesen. Flk-1-Cre Mauslinien können in Zukunft verwendet werden, um gefloxte Zielgene spezifisch in Endothelzellen zu inaktivieren. Die Rolle von Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIF) in der embryonalen Gefäßentwicklung wurde untersucht, indem HIF Signalwege im Endothel blockiert wurden. Dazu wurde eine dominant negative HIF2-alpha Mutante verwendet (HIFdn), die mittels der regulatorischen Elemente des flk-1 Gens spezifisch in Endothelzellen von transgenen Mausembryonen exprimiert wurde. Die HIFdn transgenen Embryonen zeigten eine Wachstumsretardierung und starben an Tag 11,5 der Embryonalentwicklung. In den transgenen Embryonen wurden primitive Gefäßstrukturen gebildet, was auf eine normale Vaskulogenese hinwies. Diese unreifen Gefäße wurden aber nicht remodelliert, da keine sprossende Angiogenese auftrat. In Herzen von HIFdn transgenen Embryonen zeigten sich Defekte in der Bildung von Trabekeln und in der Ausbildung der Herzschleife. Die Analyse der Genexpression zeigte, dass endotheliale Gene wie tie-2, flt-1 und flk-1 in transgenen Embryonen stark reduziert waren. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass endotheliale HIF eine essentielle Rolle in der embryonalen Angiogenese spielen. Die Regulation des humanen VEGF Rezeptor-2 Gens (KDR) wurde untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der Transkriptionsfaktor HIF2-alpha, nicht aber der verwandte HIF1-alpha die Aktivität des KDR Promotors in Reportergenexperimenten stimulierte. Potentielle HIF2 Bindungsstellen im KDR Promotor wurden identifiziert. Durch die Mutation einer dieser Bindungsstellen wurde die Aktivierbarkeit des Promotors stark reduziert. Im Vergleich zum Mausgen, zeigte das 1. Intron des humanen KDR Gens eine Region großer Sequenzidentität. Im Mausgen enthält diese Region ( Enhancer ) Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren und sie ist essentiell für die endothelspezifische Expression in vivo. Die Bindungsstellen für diese Transkriptionsfaktoren (SCL/Tal-1, Gata, Ets) sind im 1. Intron des humanen Gens konserviert, so dass sie wahrscheinlich an der Regulation der Genexpression beteiligt sind.

Summary:
Using the Cre-loxP recombination system it is possible to inactivate genes in a cell-type specific manner. In this study, regulatory elements of the flk-1 gene were fused to the Cre recombinase gene and transgenic mouse lines were established (flk-1-Cre). These mice were crossed to the reporter mouse line Rosa26R in order to analyse Cre activity in double transgenic offspring by LacZ staining. The analysis of flk-1-Cre/Rosa26R embryos or adult animals revealed a specific staining of endothelial cells of blood vessels in most organ systems. Moreover, Cre expression was detected in blood vessels of experimental BFS-1 tumours. Flk-1-Cre mouse lines can be used to inactivate floxed target genes specifically in endothelial cells. The role of hypoxia-inducible factors (HIF) during embryonic vessel development was analysed by blocking HIF signalling in endothelial cells. For that purpose, a dominant negative mutant of HIF2-alpha (HIFdn) was expressed in the endothelium of transgenic mouse embryos by using the gene regulatory elements of flk-1. HIFdn transgenic mouse embryos were growth retarded and died at day 11.5 of gestation. Primitive vascular networks were established, which indicated that in these transgenic embryos vasculogenesis was not impaired. But immature vessels were not remodelled as no angiogenic sprouting occurred. In hearts of transgenic embryos defects were observed in heart-looping and formation of the trabeculae. Gene expression analysis revealed a marked reduction of the expression levels of tie-2, flt-1 and flk-1. These results show that endothelial HIFs are essential for embryonic angiogenesis. The regulation of the human VEGF receptor-2 gene (KDR) was investigated. In reporter gene assays, the transcription factor HIF2-alpha, but not its relative HIF1-alpha, stimulated KDR promoter activity. Potential HIF2 binding sites were identified within the KDR promoter. Activation of the KDR promoter was abolished by mutating one of these sites. A region of high sequence similarity was found by comparing the first intron of the human and the mouse KDR gene. This region (enhancer) contained binding sites for transcription factors which were previously shown to be essential for endothelial cell-specific gene expression in vivo. These binding sites (SCL/Tal-1, Gata, Ets) were conserved in the first intron of the human gene, which implies a functional role in regulating gene expression.


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