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Titel: Untersuchungen zum Katalysemechanismus von Methyl-Coenzym M Reduktase (MCR) aus methanogenen Archaea
Autor: Goenrich, Meike
Weitere Beteiligte: Thauer, Rudolf (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2004
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0627
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-06277
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0627
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Probing the catalytic mechanism of methyl-coenzyme M reductase (MCR) from methanogenic archaea

Dokument

Schlagwörter:
Methangärung, Elektronenspinresonanzspektroskopie, Catalytic mechanism, Archaebakterien, Methyl-Coenzym-M-Reductase, Nickel enzymes, Nickelproteine, Radikalreaktion, EPR spectroscopy, Tetrapyrrole, Methyl-coenzyme M reductase, Factor 430

Zusammenfassung:
Die Bildung von Methan erfolgt in allen methanogenen Archeaen durch die Reduktion von Methyl-Coenzym M (CH3-S-CoM) mit Coenzym B (HS-CoB) zu CH4 und dem Heterodisulfid CoM-S-S-CoB. Diese Reaktion, die mit Umkehr der Stereokonfiguration der Methylgruppe erfolgt, wird in einem ternären Komplex-Mechanismus von Methyl-Coenzym M Reduktase (MCR) katalysiert. Das sauerstofflabile Enzym ist aus drei verschiedenen Untereinheiten zusammengesetzt, die in einem α2β2γ2 Hexamer angeordnet sind und zwei strukturell verknüpfte aktive Zentren ausbilden, in denen je ein Molekül des Nickelporphinoids Faktors F430 als prosthetische Gruppe wirkt. Im aktiven Enzym befindet sich F430 in der Oxidationsstufe Ni(I) und läßt sich durch seine paramagnetische Eigenschaft mittels Elektronenparamagnetischer Resonanz (EPR)-Spektroskopie detektieren. Derzeit lassen sich für MCR fünf EPR-aktive und zwei EPR-inaktive (silent) Zustände definieren: die enzymatisch aktiven Zustände MCR-red1 und MCR-red2, sowie die enzymatisch inaktiven Zustände MCR-ox1, MCR-ox2, MCR-ox3, MCR-ox1-silent und MCR-silent. Von den beiden Ni(II)-Formen ohne EPR Signal (MCR-ox1-silent und MCR-silent) liegen detaillierte Kristallstrukturen vor, die zusammen mit biochemischen Eigenschaften zur Formulierung von zwei alternativen Katalysemechanismen geführt haben: Mechanismus I favorisiert einen nukleophilen Angriff von Ni(I) auf die Methylgruppe von CH3-S-CoM, was zur Bildung einer Methyl-Ni(III)F430-Zwischenstufe führt. Dagegen postuliert Mechanismus II die Entstehung eines Methylradikals aufgrund eines Angriffs von Ni(I) auf den Thioetherschwefel von CH3-S-CoM. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung von Methyl-Coenzym M- und Coenzym B-Substratanaloga auf die enzymatische Akivität und den Nickel-Redoxzustand von MCR untersucht, um tiefere Einblicke in den Katalysemechanismus dieses Enzyms zu erhalten. Neben Aktivitätsmessungen wurden dazu im wesentlichen EPR-spektroskopische Untersuchungen durchgeführt. Analoga des Substrats CH3-S-CoM wurden aufgrund ihrer Wirkung in drei Gruppen unterteilt: (i) Reversible Inhibitoren wie Ethyl-Coenzym M, Propyl-Coenzym M, Allyl-Coenzym M und Coenzym M (HS-CoM), in deren Gegenwart der Ni(I)-Zustand erhalten blieb. Von den vier Inhibitoren wurde nur Ethyl-Coenzym M reduziert, allerdings mit einer katalytischen Effizienz, die geringer als 1% der Effizienz mit Methyl-Coenzym M war; (ii) Irreversible Inhibitoren wie 2-Bromoethansulfonat, 3-Bromopropionat, Cyano-Coenzym M, Seleno-Coenzym M und Trifluoromethyl-Coenzym M, die nach Zugabe zu aktiver MCR das Ni(I)-EPR-Signal auslöschten und bei Anwesenheit von HS-CoB zur Induktion eines isotropen Radikalsignals führten. Die Reaktivität des Ni(I)-Zustandes gegenüber dieser Gruppe von Inhibitoren wurde in Gegenwart von HS-CoB um das 10-fache gesteigert; und (iii) Irreversible Inhibitoren wie 3-Bromopropansulfonat, 3-Iodopropansulfonat und 4-Bromobutyrat, in deren Gegenwart das EPR Signal von aktiver MCR in das MCR-BPS-Signal umgewandelt wurde. Das MCR-BPS-Signal ist denen der MCRox-Signale ähnlich und wurde wie diese in Gegenwart von 2-Bromoethansulfonat nicht ausgelöscht. Messungen des magnetischen zirkularen Dichroismus (MCD) identifizierten Nickel im MCR-ox1-Zustand als High Spin Ni(II), welches axial mit einem Thiyl-Radikal koordiniert ist. Analog dazu könnte das MCR-BPS-Signal von einem Alkyl-Ni(III)-Zustand stammen. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit beschäftigt sich mit dem MCR-red2-Zustand, der im Enzym in Gegenwart von HS-CoM und HS-CoB induziert wird und durch ein rhombisches EPR-Signal charakterisiert ist. Eine solche Induktion wurde neben HS-CoB ebenfalls für die zwei HS-CoB-Analoga HS-CoB6 und Methyl-CoB beobachtet. Durch den Einsatz von 33S-markiertem Coenzym M konnte eindeutig gezeigt werden, daß im MCR-red2-Zustand der Thioetherschwefel von HS-CoM axial mit dem Ni(I) aus F430 koordiniert ist. Das Ausmaß der MCR-red2 Induktion durch HS-CoM und HS-CoB zeigte sich in den Untersuchungen abhängig von der Temperatur. Unterhalb von 20oC wandelte sich der red2-Zustand mit sinkender Temperatur mehr und mehr in den red1-Zustand um. Oberhalb von 20oC allerdings lagen nur maximal 50% des Enzyms im red2-Zustand vor, was u. a. dafür spricht, daß sich jeweils nur eines der beiden aktiven Zentren von MCR im red2-Zustand befindet. Dies weist auf eine Halbseitenreaktivität von MCR hin, was für eine phasenversetzte Kopplung der beiden aktiven Zentren, ähnlich wie in einem Zweitaktmotor, spricht.

Summary:
In methanogenic archaea methyl-coenzyme M reductase (MCR) catalyses the formation of methane from methyl-coenzyme M (CH3-S-CoM) and coenzyme B (HS-CoB). The enzyme has an α2β2γ2 subunit structure forming two structurally interlinked active sites each with a molecule F430 as prosthetic group. The nickel porphinoid must be in the Ni(I) oxidation state for the enzyme to be active. The active enzyme exhibits an axial Ni(I) based EPR signal and a UV-visible spectrum with an absorption maximum at 385 nm. This state is called the MCR-red1 state. In the presence of coenzyme M (HS-CoM) and coenzyme B the MCR-red1 state is in part converted reversibly into the MCR-red2 state, which shows a rhombic Ni(I) based EPR signal and a UV-visible spectrum with an absorption maximum at 420 nm. One part of the work is concerned with methyl-coenzyme M analogues showing how they affect the activity and the MCR-red1 signal of MCR from Methanothermobacter marburgensis. Ethyl-coenzyme M was the only methyl-coenzyme M analogue tested that was used by MCR as a substrate. Ethyl-coenzyme M was reduced to ethane (apparent KM = 20 mM; apparent Vmax = 0.1 U/mg) with a catalytic efficiency of less than 1% of that of methyl-coenzyme M reduction to methane (apparent KM = 5 mM; apparent Vmax = 30 U/mg). Propyl-coenzyme M (apparent Ki = 2 mM) and allyl-coenzyme M (apparent Ki = 0.1 mM) were reversible inhibitors. 2-Bromoethanesulfonate ([I]0.5V = 2 µM), cyano-coenzyme M ([I]0.5V = 0.2 mM), 3-bromopropionate ([I]0.5V = 3 mM), seleno-coenzyme M ([I]0.5V = 6 mM) and trifluoromethyl-coenzyme M ([I]0.5V = 6 mM) irreversibly inhibited the enzyme. In their presence the MRC-red1 signal was quenched indicating the oxidation of Ni(I) to Ni(II). The rate of oxidation in the presence of coenzyme B increased over 10 fold in the presence of coenzyme B indicating that the Ni(I) reactivity was increased. Enzyme inactivated in the presence of coenzyme B showed an isotropic signal characteristic of a radical, that is spin coupled with one hydrogen nucleus. The coupling was also observed in D2O. The signal was abolished upon exposure of the enzyme to O2. 3-Bromopropanesulfonate ([I]0.5V = 0.1 µM), 3-iodopropanesulfonate ([I]0.5V = 1 µM), and 4-bromobutyrate also inactivated MCR. In their presence the EPR signal of MCR-red1 was converted to a Ni based EPR signal MCR-BPS that resembles in line shape the MCR-ox1 signal. The signal was quenched by O2. 2-Bromoethanesulfonate and 3-bromopropanesulfonate, which both rapidly reacted with Ni(I) of MRC-red1, did not react with the Ni of MCR-ox1 and MCR-BPS: The Ni based EPR spectra of both inactive forms were not affected in the presence of high concentrations of these two potent inhibitors. The second part reported that the MCR-red2 state is also induced by several coenzyme B analogues and that the degree of induction by coenzyme B is temperature dependent. When the temperature was lowered below 20oC the percentage of MCR in the red2 state decreased and that in the red1 state increased. These changes with temperature were fully reversible. It was found that at most 50% of the enzyme was converted to the MCR-red2 state under all experimental conditions. These findings indicate that in the presence of both coenzyme M and coenzyme B only one of the two active sites of MCR can be in the red2 state (half-of-the-sites reactivity). Based on this interpretation a two-stroke engine mechanism for MCR is proposed.


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