Untersuchungen zum Katalysemechanismus von Methyl-Coenzym M Reduktase (MCR) aus methanogenen Archaea

Die Bildung von Methan erfolgt in allen methanogenen Archeaen durch die Reduktion von Methyl-Coenzym M (CH3-S-CoM) mit Coenzym B (HS-CoB) zu CH4 und dem Heterodisulfid CoM-S-S-CoB. Diese Reaktion, die mit Umkehr der Stereokonfiguration der Methylgruppe erfolgt, wird in einem ternären Komplex-Mechani...

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Goenrich, Meike
Beteiligte: Thauer, Rudolf (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2004
Biologie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Die Bildung von Methan erfolgt in allen methanogenen Archeaen durch die Reduktion von Methyl-Coenzym M (CH3-S-CoM) mit Coenzym B (HS-CoB) zu CH4 und dem Heterodisulfid CoM-S-S-CoB. Diese Reaktion, die mit Umkehr der Stereokonfiguration der Methylgruppe erfolgt, wird in einem ternären Komplex-Mechanismus von Methyl-Coenzym M Reduktase (MCR) katalysiert. Das sauerstofflabile Enzym ist aus drei verschiedenen Untereinheiten zusammengesetzt, die in einem α2β2γ2 Hexamer angeordnet sind und zwei strukturell verknüpfte aktive Zentren ausbilden, in denen je ein Molekül des Nickelporphinoids Faktors F430 als prosthetische Gruppe wirkt. Im aktiven Enzym befindet sich F430 in der Oxidationsstufe Ni(I) und läßt sich durch seine paramagnetische Eigenschaft mittels Elektronenparamagnetischer Resonanz (EPR)-Spektroskopie detektieren. Derzeit lassen sich für MCR fünf EPR-aktive und zwei EPR-inaktive (silent) Zustände definieren: die enzymatisch aktiven Zustände MCR-red1 und MCR-red2, sowie die enzymatisch inaktiven Zustände MCR-ox1, MCR-ox2, MCR-ox3, MCR-ox1-silent und MCR-silent. Von den beiden Ni(II)-Formen ohne EPR Signal (MCR-ox1-silent und MCR-silent) liegen detaillierte Kristallstrukturen vor, die zusammen mit biochemischen Eigenschaften zur Formulierung von zwei alternativen Katalysemechanismen geführt haben: Mechanismus I favorisiert einen nukleophilen Angriff von Ni(I) auf die Methylgruppe von CH3-S-CoM, was zur Bildung einer Methyl-Ni(III)F430-Zwischenstufe führt. Dagegen postuliert Mechanismus II die Entstehung eines Methylradikals aufgrund eines Angriffs von Ni(I) auf den Thioetherschwefel von CH3-S-CoM. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung von Methyl-Coenzym M- und Coenzym B-Substratanaloga auf die enzymatische Akivität und den Nickel-Redoxzustand von MCR untersucht, um tiefere Einblicke in den Katalysemechanismus dieses Enzyms zu erhalten. Neben Aktivitätsmessungen wurden dazu im wesentlichen EPR-spektroskopische Untersuchungen durchgeführt. Analoga des Substrats CH3-S-CoM wurden aufgrund ihrer Wirkung in drei Gruppen unterteilt: (i) Reversible Inhibitoren wie Ethyl-Coenzym M, Propyl-Coenzym M, Allyl-Coenzym M und Coenzym M (HS-CoM), in deren Gegenwart der Ni(I)-Zustand erhalten blieb. Von den vier Inhibitoren wurde nur Ethyl-Coenzym M reduziert, allerdings mit einer katalytischen Effizienz, die geringer als 1% der Effizienz mit Methyl-Coenzym M war; (ii) Irreversible Inhibitoren wie 2-Bromoethansulfonat, 3-Bromopropionat, Cyano-Coenzym M, Seleno-Coenzym M und Trifluoromethyl-Coenzym M, die nach Zugabe zu aktiver MCR das Ni(I)-EPR-Signal auslöschten und bei Anwesenheit von HS-CoB zur Induktion eines isotropen Radikalsignals führten. Die Reaktivität des Ni(I)-Zustandes gegenüber dieser Gruppe von Inhibitoren wurde in Gegenwart von HS-CoB um das 10-fache gesteigert; und (iii) Irreversible Inhibitoren wie 3-Bromopropansulfonat, 3-Iodopropansulfonat und 4-Bromobutyrat, in deren Gegenwart das EPR Signal von aktiver MCR in das MCR-BPS-Signal umgewandelt wurde. Das MCR-BPS-Signal ist denen der MCRox-Signale ähnlich und wurde wie diese in Gegenwart von 2-Bromoethansulfonat nicht ausgelöscht. Messungen des magnetischen zirkularen Dichroismus (MCD) identifizierten Nickel im MCR-ox1-Zustand als High Spin Ni(II), welches axial mit einem Thiyl-Radikal koordiniert ist. Analog dazu könnte das MCR-BPS-Signal von einem Alkyl-Ni(III)-Zustand stammen. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit beschäftigt sich mit dem MCR-red2-Zustand, der im Enzym in Gegenwart von HS-CoM und HS-CoB induziert wird und durch ein rhombisches EPR-Signal charakterisiert ist. Eine solche Induktion wurde neben HS-CoB ebenfalls für die zwei HS-CoB-Analoga HS-CoB6 und Methyl-CoB beobachtet. Durch den Einsatz von 33S-markiertem Coenzym M konnte eindeutig gezeigt werden, daß im MCR-red2-Zustand der Thioetherschwefel von HS-CoM axial mit dem Ni(I) aus F430 koordiniert ist. Das Ausmaß der MCR-red2 Induktion durch HS-CoM und HS-CoB zeigte sich in den Untersuchungen abhängig von der Temperatur. Unterhalb von 20oC wandelte sich der red2-Zustand mit sinkender Temperatur mehr und mehr in den red1-Zustand um. Oberhalb von 20oC allerdings lagen nur maximal 50% des Enzyms im red2-Zustand vor, was u. a. dafür spricht, daß sich jeweils nur eines der beiden aktiven Zentren von MCR im red2-Zustand befindet. Dies weist auf eine Halbseitenreaktivität von MCR hin, was für eine phasenversetzte Kopplung der beiden aktiven Zentren, ähnlich wie in einem Zweitaktmotor, spricht.