Röntgenkristallographische Studien von Nukleotidkofaktor-bindenden und tRNA-modifizierenden Enzymen

Röntgenkristallographische Studien von Nukleotidkofaktor- bindenden und tRNA-modifizierenden Enzymen Die Ergebnisse meiner Doktorarbeit wurden unter der Leitung von Prof. Dr. G. Klebe und PD Dr. K. Reuter am Institut für Pharmazeutische Chemie der Universität Marburg erarbeitet. Die Untersuchunge...

Ausführliche Beschreibung

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Sgraja, Tanja
Beteiligte: Klebe, Gerhard (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2004
Pharmazeutische Chemie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Röntgenkristallographische Studien von Nukleotidkofaktor- bindenden und tRNA-modifizierenden Enzymen Die Ergebnisse meiner Doktorarbeit wurden unter der Leitung von Prof. Dr. G. Klebe und PD Dr. K. Reuter am Institut für Pharmazeutische Chemie der Universität Marburg erarbeitet. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf die Aufklärung von Struktur-Wirkungsbeziehungen von potenziellen Arzneistofftargets sowie die Bestimmung von Enzymen mit neuartigen Strukturmotiven durch molekularbiologische und röntgenkristallographische Methoden. Die Arbeit umfasst vier verschiedene Themengebiete, die im Folgenden näher vorgestellt werden. Nukleotidkofaktor-bindende Enzyme Die Kristallstruktur der Carbonylreduktase Sniffer aus Drosophila melanogaster Das Sniffer-Protein aus Drosophila melanogaster ist ein Nukleotidkofaktor-bindendes Enzym. In dieser Arbeit wurde das Protein produziert, über Affinitätschromatographie gereinigt und anschließend kristallisiert. Die Selenomethionylderivat-Kristallstruktur des Sniffer-Proteins im Komplex mit NADP+ wurde durch die Methode der multiplen Wellenlängen unter Nutzung anomaler Differenzen (MAD) am Synchrotron BESSY, PSF-Beamline II in Berlin mit einer Auflösung von 1,7 Å bestimmt. Das Sniffer-Protein gehört zur Familie der Kurzkettigen Dehydrogenasen/Reduktasen. Das Enzym besteht aus einem siebensträngigen ß-Faltblatt, das auf beiden Seiten von jeweils drei Helices flankiert wird. Im aktiven Zentrum des dimeren Enzyms befindet sich die katalytische Triade. Mit Hilfe eines genetischen Docking-Algorithmus des Programms AutoDock wurden die artifiziellen Substrate des Sniffer-Proteins in die Bindetasche eingepasst, um eine Vorstellung über ihren denkbaren Bindungsmodus im aktiven Zentrum zu erhalten. In der Nähe des aktiven Zentrums befindet sich die Substratbindeschleife, die bei den meisten SDR-Enzymen aus mehr als 20 Aminosäuren besteht und erst im ternären Komplex mit Kofaktor und Substrat eine geordnete Konformation einnimmt. Im Sniffer-Protein hingegen ist die Substratbindeschleife sehr kurz und bereits im binären Komplex mit NADP+ vollständig geordnet. Das Sniffer-Protein weist, besonders im Bereich der Substratbindeschleife, eine hohe strukturelle Homologie zur Schweinecarbonylreduktase (PTCR) auf. Aus der Kristallstruktur ergibt sich eine interessante Schlussfolgerung auf eine mögliche Funktion der humanen Orthologen des Sniffer-Proteins im Hinblick auf neurodegenerative Erkrankungen. In vivo-Studien haben eindrucksvoll gezeigt, dass bei einer reduzierten Expressionsrate des sniffer-Gens der altersabhängige neurodegenerative Prozess in den Fruchtfliegen beschleunigt wird [Botella et al., 2004]. tRNA-modifizierende Enzyme Neben diesem eukaryontischen Enzym wurden tRNA-modifizierende Enzyme aus der Domäne Archaea und Eubakterien untersucht. Diese Enzyme erkennen spezifisch bestimmte Bereiche in der L-förmigen Tertiärstruktur der Transfer-RNA (tRNA). In der katalytischen Reaktion werden die Nukleotide der tRNA posttranslational modifiziert. Die Rolle des Asp280 in der katalytischen Reaktion der tRNA-Guanin Transglykosylase Die eubakterielle tRNA-Guanin Transglykosylase (TGT) spielt für die Expression beinahe aller wichtigen Virulenzfaktoren des Bakterienruhrerregers Shigella eine bedeutende Rolle. Das tRNA-modifizierende Enzym katalysiert den Austausch der Base Guanin gegen preQ1 an Position 34 der Antikodonschleife bestimmter tRNAs über einen assoziativen Mechanismus [Romier et al., 1996]. Dabei bildet die tRNA ein kovalentes Intermediat mit dem Asp280 im aktiven Zentrum [Xie et al., 2003]. In Kollaboration mit der Arbeitsgruppe von Dr. G. Garcia in der Abteilung Medizinische Chemie der Universität Michigan, USA wurde die Funktion des Asp280 untersucht [Kittendorf et al., 2003]. In biochemischen Studien mit der E. coli TGT wurde das Asp264 (entspricht Asp280 in Z. mobilis) gegen verschiedene Aminosäurereste ausgetauscht. Die E. coli TGT(D264E) ist das einzige Enzym, das eine signifikante spezifische Aktivität aufweist und in der Lage ist, einen kovalenten Komplex mit dem RNA-Substrat zu bilden. Die Anwesenheit einer Carboxylatgruppe an Position 264 ist für den Ablauf der katalytischen Reaktion essentiell. In dieser Arbeit wurde die Kristallstuktur der Z. mobilis TGT(D280E) im Komplex mit preQ1 mit einer Auflösung von 1,7 Å bestimmt und in Konsens mit den biochemischen Daten interpretiert. Im aktiven Zentrum der TGT(D280E) befindet sich das Glutamat nahezu an identischer Position wie das Aspartat in der Wildtyp-TGT. Die Glu280-Seitenkette besitzt jedoch eine sehr ausgeprägte Flexibilität. Das Wasserbrückennetzwerk zwischen dem katalytischen Nukleophil, dem Asp102 und dem Substrat ist im Gegensatz zur Wildtyp-Struktur nicht hinreichend definiert. Die Kristallstruktur der TGT(D280E) liefert eine Erklärung für die signifikante, jedoch reduzierte katalytische Aktivität der E. coli TGT(D264E). Während der katalytischen Reaktion ist nicht nur die Komplexbildung zwischen der TGT und dem RNA-Substrat, sondern auch der nukleophile Angriff des preQ1 am kovalenten Intermediat erschwert. Die archaebakterielle tRNA-Guanin Transglykosylase Im Gegensatz zur eubakteriellen tRNA-Guanin Transglykosylase katalysiert das archaebakterielle Enzym den Austausch der Base Guanin gegen die modifizierte Base preQ0 an Position 15 in die D-Schleife der meisten tRNAs. Das preQ0 wird anschließend zur hypermodifizierten Base Archaeosin umgewandelt [Watanabe et al., 1997]. Im Vergleich zu den eubakteriellen TGTasen besitzen diese Enzyme eine zusätzliche, archaespezifische C-terminale Domäne, die ein neuartiges Faltungsmuster aufweist und für die tRNA-Bindung verantwortlich ist [Romier et al., 1997]. Auch innerhalb der Domäne Archaea unterscheiden sich die Enzyme signifikant in der Länge dieser C-terminalen Domäne. Um einen Einblick in das neuartige Faltungsmuster der C-terminalen Domäne der TGT zu erhalten, wurden die tgt-Gene aus den hyperthermophilen Spezies Archaeglobus fulgidus, Aeropyrum pernix und Pyrococcus horikoshii amplifiziert und kloniert. Nach der rekombinanten Expression der tgt-Gene waren die resultierenden TGT-Enzyme im Rohextrakt sehr gut löslich. Für die Archaeglobus fulgidus TGT wurde ein Reinigungs-protokoll etabliert und anschließend Kristallisationsversuche durchgeführt. In Kristallisations-ansätzen wurden Kristalle der A. fulgidus TGT erhalten, die jedoch nicht reproduzierbar waren. Wie sich zeigte, handelte es sich bei diesen Kristallen um ein 42 kDa großes Abbauprodukt der A. fulgidus TGT, das der N-terminalen Domäne zugewiesen wurde. Um dies zu bestätigen, wurde die kodierende Sequenz der N-terminalen Domäne kloniert und überexprimiert. Das resultierende Protein wurde erfolgreich in hoher Ausbeute gereinigt und Kristallisationsversuche durchgeführt. Parallel wurden auch die C-terminalen Domänen der A. fulgidus und A. pernix TGT aus den kompletten tgt-Genen amplifiziert und gereinigt. Die Kristallstrukturen der A. fulgidus und A. pernix TGT bzw. ihrer N- und C-terminalen Domänen konnten in dieser Arbeit nicht bestimmt werden, da keine reproduzierbaren, diffraktions-fähigen Kristalle erhalten werden konnten. Die Domänen der S-Adenosylmethionin: tRNA-Ribosyltransferase/Isomerase Auch die S-Adenosylmethionin: tRNA-Ribosyltransferase/Isomerase (QueA) zählt zu den tRNA-modifizierenden Enzymen. Das QueA-Enzym überträgt in einer außergewöhnlichen Reaktion den Riboserest des Kofaktors S-Adenosylmethionin auf die Base preQ1 in der modifizierten tRNA. Durch Röntgenstrukturanalyse wurde ein erstes Strukturmodell der B. subtilis QueA mit einer Auflösung von 3,0 Å bestimmt. Das Modell zeigt, dass das Enzym aus zwei Domänen besteht. Die größere Domäne weist ein neuartiges Faltungsmuster auf. Das Strukturmodell ist jedoch mit extrem hohen B-Faktoren behaftet und wird gegenwärtig den Anforderungen an eine vollständige und zuverlässige Kristallstruktur nicht gerecht [Grimm, 2000]. Um die Qualität des Strukturmodells zu verbessern, wurden die Domänen durch Mutageneseverfahren erfolgreich voneinander getrennt, die Proteinfragmente in löslicher Form produziert und gereinigt. Aus einem breit angelegten Screening konnten gut reproduzierbare Proteinkristalle von der kleineren Domäne der B. subtilis QueA erhalten werden. Es wurde bereits versucht, die Kristallisationsbedingungen zu optimieren. Für Röntgenbeugungsexperimente sind die Kristalle jedoch noch nicht von ausreichender Qualität.