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Zusammenfassung:
Der Zellkern eukaryotischer Zellen zeichnet sich durch zahlreiche morphologisch sowie funktionell unterschiedliche Domänen aus, die als Kernkompartimente bezeichnet werden. Zu ihnen gehören u. a. der Nukleolus und die Promyelozytische Leukämie (PML) Protein Kerndomänen, die als dynamische subnukleäre Strukturen bei der Regulation des Zellzyklus, der Apoptose, der Transkription, der Tumorsuppression und der zellulären, antiviralen Antwort eine wichtige Bedeutung besitzen. Die Funktion sowie die Regulation der in Kerndomänen ablaufenden Prozesse sind gegenwärtig weitgehend nur unzureichend verstanden. Ziel dieser Dissertation war es, neue Kerndomänen-assoziierte Komponenten zu identifizieren und zu charakterisieren. Diese Studien sollten zu einem besseren Verständnis der Funktion von Kerndomänen beitragen. Zu diesem Zweck wurden neue, nicht charakterisierte proteinkodierende Abschnitte von in Sequenzdatenbanken bis zu diesem Zeitpunkt nicht annotierten cDNAs an EYFP fusioniert, in humanen Zelllinien exprimiert und auf ihre subzelluläre Lokalisation analysiert. Zwei dieser neuen Proteine konnten aufgrund ihrer Lokalisation als neue Kerndomänen-assoziierte Komponenten identifiziert werden. Bei einem der beiden Proteine, dem PAROT (PML-associated repressor of transcription)-Protein, handelt es sich um einen Repressor der Transkription, der eine N-terminale Repressordomäne, eine KRAB- (Krüppel associated box) Domäne, eine Linker-Domäne und eine C-terminale C2H2-Zinkfinger (ZNF)-Domäne zur DNA-Bindung, sowie drei Konsensus- Kernlokalisationssignale (NLS) besitzt. Anhand seiner Domänenstruktur konnte PAROT der ZNF91-Proteinfamilie der „multiple-adjacent“-KRAB-C2H2-Zinkfinger Proteine zugeordnet und das zugehörige Gen, ebenso wie die meisten anderen Mitglieder der ZNF91-Proteinfamilie, auf dem Chromosom 19p13.11 kartiert werden. Die PAROT mRNA konnte in verschiedenen menschlichen Geweben wie Skelettmuskel, Niere, Dickdarm und Gehirn als ein 4.4 kb Transkript nachgewiesen werden. Ektopisch exprimiertes PAROT-Protein lokalisiert in Kerndomänen und kann durch die PML-Isoform IV in PML-Kerndomänen rekrutiert werden. Weiterhin kolokalisiert es mit dem Korepressor TIF1b sowie mit Mitgliedern der Heterochromatin Protein 1 (HP1)-Proteinfamilie, was vermuten lässt, dass das PAROT-Protein, ähnlich wie andere KRAB-ZNF Repressoren, über die direkte Interaktion mit TIF1b die Genexpression reprimiert. Die Repression der Transkription durch das PAROT-Protein kann aufgrund der Rekrutierung durch die PML-Isoform PML IV in PML-Kerdomänen dosisabhängig aufgehoben werden. Somit handelt es sich bei PAROT um einen durch seine Assoziation mit PML-Kerndomänen regulierbaren Transkriptionsrepressor. Indirekte Immunfluoreszenzanalysen mit unterschiedlichen gegen das PAROT-Protein gerichteten Antikörpern zeigten unerwarteterweise eine Kolokalisation von PAROT mit Mitochondrien, was als Hinweis verstanden werden kann, dass PAROT nur auf bestimmte Stimuli hin in den Zellkern einwandert und seine Zielgene reprimiert. Das zweite identifizierte Kerndomänenprotein, Nucleostatmin, besitzt zwei putative NLS, eine mögliche Nukleoluslokalisierungssequenz (NoLS) und ein RNA-Erkennungsmotiv (RRM), das dieses Protein als ein RNA-bindendes Protein klassifiziert. Nucleostatmin ist ein in Maus und Ratte konserviertes Protein und zeigt eine starke Sequenzhomologie zum Protein aus Maus und Ratte, die besonders in den Bereichen des RRM und der möglichen NoLS ausgeprägt sind. Ektopisch exprimiertes Nucleostatmin lokalisierte überwiegend im Nukleoplasma, war jedoch auch im Nukleolus nachweisbar. Endogenes Nucleostatmin Protein ist zusammen mit der DNA-abhängigen RNA Polymerase I und dem UBF Protein in fibrillären Zentren des Nukleolus lokalisiert. Wurde die DNA-abhängige RNA-Synthese der RNA Pol I durch AMD inhibiert, lokalisierte Nucleostatmin nicht mehr im Nukleolus, sondern war diffus im Nukleoplasma verteilt. Demnach übt Nucleostatmin möglicherweise eine Funktion auf transkriptioneller oder post-transkriptioneller Ebene der rRNA Transkription aus. Zwei neue, unbekannte Kerndomänen-assoziierten Proteine konnten mithilfe dieses methodischen Lösungsansatzes identifiziert und charakterisiert wurden. Es stellte sich im Laufe dieser Arbeit heraus, dass dabei die Lokalisation der EYFP-Fusionsproteine nicht zwingend der des endogenen Proteins entspricht, was erstmals eine Schwachstelle dieses Ansatzes zur Identifizierung neuer Kerndomänenkomponenten aufzeigt. Dennoch bestätigte sich für PAROT als ersten Vertreter der KRAB-C2H2-Zinkfinger Proteinfamilie nachweislich eine PML-Kerndomänen Assoziation. Interessanterweise wurde auch ein weiteres KRAB-C2H2-Zinkfinger, KRIM1A, von PML IV in PML-Kerndomänen rekrutiert. Eine PML-Kerndomänen Assoziation von Nucleostatmin bleibt zu analysieren. Mit großer Wahrscheinlichkeit handelt es sich hierbei um ein neues RNA-bindendes, nukleoläres Protein, das eine noch unbekannte Funktion in der rRNA Transkription ausübt.

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