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Titel: Isolation und Charakterisierung der sporulationsspezifischen Protease LonB von Bacillus subtilis
Autor: Hövel, Sven
Weitere Beteiligte: Völker, Uwe (Dr.)
Erscheinungsjahr: 2004
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0068
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0068
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-00685
DDC: 570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Isolation and characterisation of the sporulation specific protease LonB of Bacillus subtilis

Dokument

Schlagwörter:
Bacillus subtilis, Lon-proteases, Lon-Proteasen, Bacillus subtilus, Proteasen

Zusammenfassung:
Der Einsatz von Proteasen zur Regulation physiologischer oder genregulatorischer Prozesse ist bei Mikroorganismen ein weit verbreitetes Phänomen. Ein Großteil des proteolytischen Abbaus unterliegt dabei dem Energiestatus der Zelle. Im Genom von Bacillus subtilis sind zwei Mitglieder der Familie prokaryotischer ATP-abhängiger Serin-Proteasen kodiert. Die erste, LonA, wird als Folge von Stresseinwirkung wie Hitze, Ethanol-, osmotischem und oxidativem Stress und nach Behandlung mit Puromycin verstärkt synthetisiert. Eine Rolle bei der negativen Regulation der SigG-Aktivität unter Bedingungen, die die Sporulation nicht induzieren, wird vermutet. Das Gen der zweiten Protease, lonB, liegt direkt upstream des lonA-Genes. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß die Transkription von lonB der Kontrolle des ersten Sigma-Faktors der Vorspore, SigF, unterliegt, und die Expression auf dieses Kompartiment begrenzt ist. DNA-Array-Analysen von Zellen, in denen die Expression sigF artifiziell induziert wurde, zeigten einen deutlichen Anstieg der Menge des lonB-Transkriptes, und durch Northern-Analyse konnte ein monocystronisches Transkript nachgewiesen werden. Fluoreszenz von Stämmen, die eine lonB-gfp-Fusion trugen, war ausschließlich in der Vorspore zu detektieren und von der Gegenwart des Transkriptionsfaktors SigF abhängig. Die Transkription wurde an einem spezifischen Startpunkt initiiert, der durch Primer-Extension-Analyse identifiziert werden konnte, und vor dem Sequenzen liegen, die bekannten SigF-abhängigen Promotoren gleichen. Sowohl LonB, als auch LonA, waren in Zellextrakten des Wildtyps mit Hilfe spezifischer polyklonaler Antikörper nachweisbar; LonB erschien ca. 90 min nach Beginn der Sporulation, LonA war dagegen schon während des vegetativen Wachstums zu beobachten. In vitro konnte die Peptidase- und ATP-abhängige Protease-Aktivität beider Enzyme demonstriert werden, zudem ist eine assoziierte ATPase-Aktivität sehr wahrscheinlich. Die Inaktivierung von lonA und lonB durch Insertion von Resistenzkassetten hatte keine Auswirkung auf den Phänotyp vegetativer oder sporulierender Wildtyp-Zellen, und auch die Transkription von Genen unter der Kontrolle der Sporulations-Sigmafaktoren, SigF, SigG und SigK war in der lonB-Mutante unverändert. Vergleichende 2D-Gel-Analyse zwischen dem Wildtyp und lon-Mutanten lassen einen Einfluss der LonB-Protease auf die Menge der mutterzellspezifischen Serin-Protein-Kinase PrkA vermuten, der bedingt durch die unterschiedliche Lokalisierung wahrscheinlich indirekt ist.

Summary:
The use of proteases for the regulation of physiological and regulatory processes in Microorganisms is a widely distributed phenomenon. Most of all proteolytic breakdown is dependent on the energetic status of the cell. The genome of Bacillus subtilis codes for two members of the family of ATP-dependent Serine proteases.The synthesis of the first one,which is LonA, increases in response to heat stress, ethanol, osmotic and oxidative stress and after treatment with puromycin. Furthermore a role in the negative regulation of SigA-activity under non sporulation inducing conditions is suspected. The gen of the second protease, lonB, is located immediately upstream of lonA. This study shows that transcription of lonB is controlled by the first forespore specific sigma factor, SigF, and that it?s expression is restricted to that compartment. DNA-array analysis of cells after artificial induction of sigF expression revealed a significant increase of the amount of lonB transcript and Northern analysis showed a monocystronic transcript. Flourescence of strains carrying a lonb-GFP fusion was exclusively detected in the forespore and depended on the presence of the transcription factor SigF. Transcription was initiated at a specific start point that was identified by primer extension analysis and that is located downstream of sequences similar to known sigF dependent sequences. Both LonB and LonA were proven to be present in crude cell extracts using specific polyclonal antibodies. LonB appeared 90 min after onset of sporulation, whereas LonA could be found allready during vegetative growth. In vitro both peptidase and ATP-dependent protease activity could be demonstrated for both enzymes, and an associated ATPase activity is very likely. Inactivation of lonA and lonB by insertion showed no effect on the phenotype of vegetative and sporulating cells, and transcription of genes controlled by the sporulation sigma factors SigF, SigG and SigK was not affected in a lonB-mutant. Comparative 2D-gel analysis of wildtype and lon-mutants lead to the assumption that LonB may influence the ammount of the mothercell specific serin protein kinase PrkA, but as LonB and PrkA are restricted to different compartments the effect may be indirect.


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