Isolation und Charakterisierung der sporulationsspezifischen Protease LonB von Bacillus subtilis

Der Einsatz von Proteasen zur Regulation physiologischer oder genregulatorischer Prozesse ist bei Mikroorganismen ein weit verbreitetes Phänomen. Ein Großteil des proteolytischen Abbaus unterliegt dabei dem Energiestatus der Zelle. Im Genom von Bacillus subtilis sind zwei Mitglieder...

Ausführliche Beschreibung

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Hövel, Sven
Beteiligte: Völker, Uwe (Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2003
Biologie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Der Einsatz von Proteasen zur Regulation physiologischer oder genregulatorischer Prozesse ist bei Mikroorganismen ein weit verbreitetes Phänomen. Ein Großteil des proteolytischen Abbaus unterliegt dabei dem Energiestatus der Zelle. Im Genom von Bacillus subtilis sind zwei Mitglieder der Familie prokaryotischer ATP-abhängiger Serin-Proteasen kodiert. Die erste, LonA, wird als Folge von Stresseinwirkung wie Hitze, Ethanol-, osmotischem und oxidativem Stress und nach Behandlung mit Puromycin verstärkt synthetisiert. Eine Rolle bei der negativen Regulation der SigG-Aktivität unter Bedingungen, die die Sporulation nicht induzieren, wird vermutet. Das Gen der zweiten Protease, lonB, liegt direkt upstream des lonA-Genes. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß die Transkription von lonB der Kontrolle des ersten Sigma-Faktors der Vorspore, SigF, unterliegt, und die Expression auf dieses Kompartiment begrenzt ist. DNA-Array-Analysen von Zellen, in denen die Expression sigF artifiziell induziert wurde, zeigten einen deutlichen Anstieg der Menge des lonB-Transkriptes, und durch Northern-Analyse konnte ein monocystronisches Transkript nachgewiesen werden. Fluoreszenz von Stämmen, die eine lonB-gfp-Fusion trugen, war ausschließlich in der Vorspore zu detektieren und von der Gegenwart des Transkriptionsfaktors SigF abhängig. Die Transkription wurde an einem spezifischen Startpunkt initiiert, der durch Primer-Extension-Analyse identifiziert werden konnte, und vor dem Sequenzen liegen, die bekannten SigF-abhängigen Promotoren gleichen. Sowohl LonB, als auch LonA, waren in Zellextrakten des Wildtyps mit Hilfe spezifischer polyklonaler Antikörper nachweisbar; LonB erschien ca. 90 min nach Beginn der Sporulation, LonA war dagegen schon während des vegetativen Wachstums zu beobachten. In vitro konnte die Peptidase- und ATP-abhängige Protease-Aktivität beider Enzyme demonstriert werden, zudem ist eine assoziierte ATPase-Aktivität sehr wahrscheinlich. Die Inaktivierung von lonA und lonB durch Insertion von Resistenzkassetten hatte keine Auswirkung auf den Phänotyp vegetativer oder sporulierender Wildtyp-Zellen, und auch die Transkription von Genen unter der Kontrolle der Sporulations-Sigmafaktoren, SigF, SigG und SigK war in der lonB-Mutante unverändert. Vergleichende 2D-Gel-Analyse zwischen dem Wildtyp und lon-Mutanten lassen einen Einfluss der LonB-Protease auf die Menge der mutterzellspezifischen Serin-Protein-Kinase PrkA vermuten, der bedingt durch die unterschiedliche Lokalisierung wahrscheinlich indirekt ist.