Theoretische und experimentelle Untersuchungen zur Inhibition des Enzyms Aldose Reduktase

Thema der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Inhibition des Enzyms Aldose Reduktase. Eine Besonderheit dieses Enzyms liegt in der ausgeprägten Anpassungsfähigkeit der Bindetasche bei der Ligandenbindung. Das Ausmaß dieser Rezeptorflexibilität wurde durch den ausführlich...

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Krämer, Oliver
Beteiligte: Klebe, Prof. Dr. Gerhard (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2003
Pharmazeutische Chemie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Thema der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Inhibition des Enzyms Aldose Reduktase. Eine Besonderheit dieses Enzyms liegt in der ausgeprägten Anpassungsfähigkeit der Bindetasche bei der Ligandenbindung. Das Ausmaß dieser Rezeptorflexibilität wurde durch den ausführlichen Vergleich bekannter Kristallstrukturen und mit Hilfe von molekulardynamischen Simulationen untersucht. Beim Vergleich der bekannten Kristallstrukturen zeigte sich, dass bislang nur vier unterschiedliche ?Hauptkonformationen? kristallographisch beobachtet wurden. Als Startstruktur für die MD-Simulationen wurde die Geometrie der Kristallstruktur der humanen Aldose Reduktase im Komplex mit dem Inhibitor IDD594 verwendet. Bei zwei der drei Simulationen wurde der Ligand zuvor aus der Startstruktur entfernt. Die verschiedenen MD-Simulationen waren in Lage, eine Vielzahl weiterer Konformationen zu generieren, die ?Zwischenzustände? der bereits bekannten Konformationen darstellen. Dies zeigt, wie wertvoll MD-Simulationen zur Generierung eines Ensembles relevanter Proteinkonformationen sein können, gerade bei Ziel-Proteinen für die nur sehr wenige Kristallstrukturen zur Verfügung stehen. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die Suche nach neuen Inhibitoren der Aldose Reduktase. Das virtuelle Screening wurde dabei zunächst auf die in der hochaufgelösten IDD594-Komplexstruktur beobachtete Proteinkonformation beschränkt. In diesem Ansatz wurde also die Flexibilität des Rezeptors vernachlässigt. Die Vorteile der IDD594-Komplexstruktur liegen (a) in der hohen Auflösung, die exakte Informationen über die Protonierungszustände von Protein und Ligand liefert, und (b) in dem Vorliegen einer hydrophoben Spezifitätstasche, deren Besetzung zu einer hohen Affinität und Spezifität der Liganden gegenüber eng verwandten Enzymen (wie z.B. der Aldehyd Reduktase) führt. Die Bindetasche wurde einer Hot Spot-Analyse unterzogen, um aus den dabei identifizierten bevorzugten Wechselwirkungsbereichen eine Pharmakophor-Hypothese abzuleiten, die für eine 3D-Datenbanksuche verwendet wurde. Abschließend wurden die Kandidatenmoleküle flexibel in die Bindetasche eingepasst und einer visuellen Inspektion unterzogen. Ebenfalls untersucht wurde, inwieweit es ein Ligand basierender Ansatz erlaubt, die Flexibilität des Rezeptors bei der virtuellen Datenbanksuche zu berücksichtigen. Die Idee war, bekannte Inhibitoren der Aldose Reduktase als Abbild der entsprechenden Proteinkonformationen zu verwenden. Die hier berücksichtigten Inhibitoren sind Stellvertreter für drei der vier zuvor erwähnten ?Hauptkonformationen? der Aldose Reduktase. Aus der Überlagerung der Inhibitoren wurde eine Pharmakophor-Hypothese abgeleitet und für die Datenbanksuche verwendet. Anschließend wurden die Inhibitoren vereinigt und als Referenz für die paarweise Überlagerung der Kandidatenmoleküle verwendet. Aus beiden Datenbanksuchen konnten neue Inhibitoren der Aldose Reduktase mit Affinitäten im mikromolaren Bereich identifiziert werden. Das Ziel der durchgeführten virtuellen Datenbanksuchen war, Leitstruktur-ähnliche Verbindungen zu finden, deren Affinität in weiteren Design-Zyklen optimiert werden kann. Ein Beispiel dafür ist die Derivatisierung eines bereits bekannten Inhibitors. Das beste Derivat zeigt eine 30fach höhere Affinität als die Ausgangsverbindung. Die Struktur dieses Inhibitors im Komplex mit humaner Aldose Reduktase konnte aufgeklärt werden. Dabei wurde ein neuer Bindungsmodus beobachetet, bei dem ein Citrat-Molekül die Wechselwirkung des Inhibitors mit dem Protein verbrückt. Die Analyse dieser Wechselwirkungen wird in der Zukunft als Grundlage für eine neue Design-Strategie zur weiteren Verbesserung der Affinität dienen. Dies unterstreicht die Bedeutung des Zusammenwirkens von Computermethoden und Röntgenkristallographie bei der Entwicklung neuer Inhibitoren. Des Weiteren wurden im Rahmen dieser Arbeit ITC-Messsungen bei pH 8,0 und bei 25°C mit einer Reihe von AR-Inhibitoren durchgeführt, um ein thermodynamisches Profil der Bindung des jeweiligen Inhibitors zu erhalten. Nach der Berücksichtigung von Korrekturtermen für die Ioniserung des Puffers und funktioneller Gruppen des Liganden, war eine strukturbezogene Interpretation der erhaltenen thermodynamischen Daten möglich. Anhand der in Abhängigkeit von dem Oxidationszustand des Kofaktors beobachteten Protonierungsänderungen bei der Ligandenbindung konnten Rückschlüsse auf den Liganden-Bindungsmechanismus gezogen werden.