Regulation of Ebola virus transcription by the viral nucleoprotein: Impact of protein interactions and post-translational modifications

Das Ebola Virus (EBOV) gehört zur Familie der Filoviridae und zur Ordnung der Mononegavirales. Sporadische EBOV-Ausbrüche in Afrika südlich der Sahara sind durch eine hohe Letalitätsrate von 40-90 % gekennzeichnet. Die Replikation und Transkription des negativsträngigen viralen Genoms wird durch die virale Polymerase L und ihren Kofaktor, das virale Protein (VP) 35, ermöglicht. Während diese beiden Proteine für die virale Replikation ausreichen, ist die Transkription zusätzlich von dem Transkriptionsfaktor VP30 abhängig. Ob VP30 Teil des Transkriptasekomplexes ist, hängt von seinem Phosphorylierungsstatus ab: dephosphoryliertes VP30 unterstützt aktiv die virale Transkription, die phosphorylierte Form wird dagegen nicht mehr vom Polymerasekomplex rekrutiert und folglich wird die Transkription nicht mehr unterstützt. Die zelluläre Proteinphosphatase 2A (PP2A) spielt eine wichtige Rolle bei der Dephosphorylierung von VP30 und in Folge dessen auch für die virale Transkription. Das virale Nukleoprotein (NP) spielt eine Schlüsselrolle bei der Dephosphorylierung von VP30, indem es die beiden Proteine PP2A und VP30 rekrutiert, was sie in engen Kontakt zueinander bringt und die Dephosphorylierung von VP30 ermöglicht. NP ist ein äußerst vielseitiges Protein, das nicht nur für die Verpackung von genomischer und antigenomischer RNA unerlässlich ist, sondern auch eine wichtige Rolle bei der Rekrutierung von viralen und Wirtsproteinen spielt, um die virale Transkription und Replikation zu ermöglichen. Im ersten Teil dieser Studie wurde der Einfluss von NP auf die effiziente Dephosphorylierung von VP30 durch PP2A untersucht. Wir konnten zeigen, dass beide Proteine eine ortsspezifische Rekrutierung durch NP benötigen, die sie in engen Kontakt bringt. Eine weitere Trennung der Bindungsstellen auf NP führte zu einer Verringerung der primären Transkription, die mit einem erhöhten Phosphorylierungsstatus von VP30 in Verbindung gebracht werden konnte. Dieser Phänotyp wurde in authentischen EBOV bestätigt, die eine Abschwächung eines rekombinanten Virus mit einem größeren Abstand zwischen den PP2A- und VP30-Bindungsstellen auf NP zeigten. Dabei identifizierten wir eine kompensatorische Punktmutation, die während der Generierung der rekombinanten Viren im NP-Gen auftrat (NP T603I). Die folgenden Experimente zeigten, dass die NP-Mutation die Virusvermehrung eines ansonsten nicht lebensfähigen Virus vollständig wiederherstellte. Die Mutation wurde sowohl einzeln als auch im Zusammenhang mit den NP-Linker Mutanten untersucht, um ihre drastische Auswirkung auf die virale Vermehrung zu charakterisieren. Dabei zeigte sich eine spezifische Kompensation des Linker-bedingten Wachstumsdefekts durch NP T603I, während die Mutation allein für den viralen Lebenszyklus nachteilig war. Durch massenspektrometrische Analysen konnten wir eine Phosphorylierung von NP T603 in viralen Partikeln nachweisen, während die Phosphorylierung nach zellulärer Expression nicht nachgewiesen werden konnte. Durch die Verwendung phosphomimetischer NP T603-Mutanten konnten wir zeigen, dass eine dynamische Phosphorylierung an dieser Position innerhalb desselben NP-Moleküls für eine effiziente virale Vermehrung wichtig ist, was der erste Beweis für eine funktionelle Bedeutung von NP-Phosphorylierung ist. Neben PP2A und VP30 interagiert EBOV NP bekanntermaßen auch mit dem lysine methyltransferase SET and MYND domain-containing protein 3 (SMYD3). Interessanterweise befindet sich seine Interaktionsstelle zwischen den Bindungsstellen von PP2A und VP30, und die Bindung des Proteins soll an der Transkriptions-Regulation beteiligt sein. Unsere Ergebnisse deuten jedoch nicht auf eine wichtige Rolle von SMYD3 oder seiner enzymatischen Funktion für den viralen Lebenszyklus hin. Ein Übermaß an SMYD3-Expression führte zu einer Hemmung der EBOV-Transkription und -Replikation, während es keine Auswirkungen auf den Lebenszyklus von MARV und LLOV hatte. Obwohl SMYD3 für den EBOV-Lebenszyklus wahrscheinlich entbehrlich ist, konnten wir zum ersten Mal Methylierung von NP an mehreren Arginin- und Lysin-Resten durch Massenspektrometrie nachweisen. Der Einbau verschiedener Mitglieder der protein arginine methyltransferase (PRMT)-Familie in virale Partikel deutet auf ihre Beteiligung an der EBOV NP Methylierung hin, was in weiteren Studien bestätigt werden muss. Diese Studie unterstreicht die wesentliche Rolle von NP als Regulator der viralen Transkription und Replikation. NP ermöglicht viele verschiedene Funktionen während des viralen Lebenszyklus, die über die Interaktion mit viralen und zellulären Proteinen sowie mit RNA reguliert werden. Diese Prozesse werden häufig durch posttranslationale Modifikationen beeinflusst. Unsere Studie identifiziert die große intrinsisch ungeordnete Region im C-terminalen Teil des Proteins als eine wichtige strukturelle Komponente, die die Bindung von PP2A, SMYD3 und VP30 vermittelt. Die gleiche Region ist auch stark durch PTMs modifiziert und unterliegt einem hohen evolutionären Druck. Diese spezialisierte Region von NP ermöglicht eine strukturelle Variabilität, von der angenommen wird, dass sie ein wichtiger Faktor für die große Vielfalt an EBOV NP Interaktionen und somit Funktionen während des viralen Lebenszyklus ist.