Biosynthesis of alkaloids from Penicillium palitans and malfilanol D from Aspergillus ustus

Naturstoffe (NPs), strikt beschränkt auf sekundäre Metaboliten (SMs), weisen eine hohe strukturelle Vielfalt und Komplexität auf, darunter Alkaloide, Phenylpropanoide, Polyketide und Terpenoide mit ihren einzigartigen pharmakologischen oder biologischen Aktivitäten. Viele wirksame Antibiotika wurden nacheinander aus den Schlauchpilzen Penicillium, Cephalosporium, Aspergillus usw. entdeckt. Davon ausgehend wurden immer mehr Naturprodukte entdeckt, die zur Dereplikation führten. Der Nachteil liegt auf der Hand. Die herkömmliche Isolierung aus natürlichen Ressourcen kann den Anforderungen der medizinischen Behandlung aufgrund technischer Barrieren, geringer Ausbeuten und Schäden an natürlichen Organismen nicht gerecht werden. Die Leitssubstanzen mit komplexen Strukturen, z. B. funktionelle Gruppen mit chiralen Zentren und instabile Moleküle mit Umlagerung sind aufgrund langwieriger und unübersichtlicher Schritte und geringer Ausbeute schwer zu synthetisieren. Mithilfe genetischer Werkzeuge werden Zellfabriken zu einer Methode, um derartige Herausforderungen durch die De-novo-Entwicklung von Biosynthesewegen zu bewältigen. Zur Aufklärung des Biosynthesemechanismus wurden fortschrittliche Bioinformatik, biologische Technologien und biochemische Werkzeuge eingesetzt, um die kodierenden Gene zu untersuchen, die normalerweise zusammen als biosynthetische Gencluster (BGC) angeordnet sind. BGCs enthalten normalerweise Rückgratenzyme, die für das Gerüst der NPs zuständig sind, und Modifikationsenzyme, die für die Veränderungen des Skeletts zuständig sind. Enzymvermittelte Reaktionen erhöhen die Diversität der NP-Strukturen enorm. Außerdem treten bei der Bildung von NPs gelegentlich auch nicht-enzymatische Reaktionen auf. In dieser Arbeit wurde in Zusammenarbeit mit Zhanghai Li die Biosynthese von Alkaloiden aus Penicillium palitans aufgeklärt, und in Zusammenarbeit mit Marlies Peter wurde der Bildungsmechanismus eines Sesquiterpenoids aus Aspergillus ustus durch Isotopenmarkierung durchgeführt. Zur Untersuchung der Alkaloid-Biosynthese in P. palitans (Projekte 3.1 und 3.2) wurden zunächst die SMs identifiziert. Die Kultivierung von P. palitans in mCDH-Medium bei 25 °C für 15 Tage und die LC-MS-Analyse ergaben das Vorhandensein von mindestens acht Metaboliten. Darunter wurden die Alkaloide Cyclopenol (1), Viridicatol (6) und Cyclopiazonsäure (7, CPA) als dominante Produkte und Speradin F (8) als Nebenprodukt des Wildtyps identifiziert. Anschließend wurde mittels bioinformatischer Analyse ein entsprechende Genom Analyse durchgeführt. Drei NRPS- oder PKS-NRPS-abgeleitete Alkaloide, die Aminosäuren enthalten, wurden aufgrund des enzymatischen Potenzials in ihren entsprechenden BGCs für die Bildung der Meta-Hydroxylierung an einem monosubstituierten Benzolring und hoch multihydroxilierten Tetrahydrofuran weiter untersucht. Genom Analyse, Gendeletion und heterologe Expression führten zur Identifizierung von zwei separaten Clustern, dem verantwortlichen vdo Cluster mit vier Genen für die Bildung des Cyclopeninskeletts und dem spe Cluster mit fünf Genen für die Bildung des CPA-Skeletts. Fütterungsexperimente bewiesen, dass das Cytochrom-P450-Enzym VdoD den Schlüsselschritt bei der Umwandlung von Cyclopenin (2) in Cyclopenol (1) katalysiert, was eine weniger untersuchte enzymatische Meta-Hydroxylierung an einem monoalkylierten Benzolring demonstriert. Durch heterologe Expression (HE) konnte nachgewiesen werden, dass der spe-Cluster für die Bildung von CPA und seinen Derivaten (7 – 12) verantwortlich ist, und es zeigte sich, dass das stark hydroxilierte Speradine F (8) durch mehrere nicht-enzymatische Oxidation synthetisiert wurde. Diese Arbeit klärt die Biosynthese von Viridicatol und Speradine F und veranschaulicht zwei Hydroxylierungsreaktionen in der Biosynthese. Für die Identifizierung des katalytischen Mechanismus von Sesquiterpenen (Projekt 3.3) zogen wir es vor, zunächst eine Genomanalyse durchzuführen und dann die Funktion durch HE, biochemische Charakterisierung mit rekombinantem Protein und Isotopenmarkierungsexperimente nachzuweisen. Die Sequenzanalyse des Genoms von A. ustus führte zur Identifizierung einer uncharakterisierten putativen Terpenzyklase, die im Folgenden als MfdS bezeichnet wird. HE im Modellorganismus Aspergillus nidulans LO8030 wurde zum Nachweis der Genfunktion verwendet. Ein zusätzlicher Metabolit wurde mittels LC-MS nachgewiesen und anschließend aus der Kultur eines Transformanten isoliert. Die Auswertung der NMR-Daten, einschließlich 1H-NMR, 13C-NMR, 1H-1H-COSY, HSQC, HMBC und 1H-1H-NOESY, ergab, dass es sich bei dem auffälligen Peak um die neue Verbindung Malfilanol D (13) handelt. Um zu beweisen, dass MfdS allein für die Bildung von Malfilanol D verantwortlich ist, wurde ein Enzymtest von Farnesyl-Diphosphat (FPP, C15) mit dem rekombinanten Protein durchgeführt. Darüber hinaus wurde anhand von 13C-Acetat-Markierungsexperimenten eine neuartige Sesquiterpenyzklase aus Aspergillus ustus für die Biosynthese der weniger untersuchten Bicyclo[5.4.0]undecan-Sesquiterpene nachgewiesen. Die 1,2-Alkylverschiebung innerhalb des Allylkations führt zu einer Ringerweiterung, und der sukzessive 1,2-Hydridtransfer, der C-1- bis C-6-Ringschluss und die Abscheidung von Wasser liefern das Endprodukt Malfilanol D. Die drei Fälle, in denen Produkte aus NRPS, PKS-NRPS und TC aus den Ascomyceten Penicillium palitans und Aspergillus ustus untersucht wurden, zeigen, dass Pilze ein vielversprechender Pool für die Nutzung bioaktiver SMs und interessanter Enzyme sind, indem ihre komplette Biosynthese aufgeklärt wird.