Molecular Investigations on the Type-specific Antigen 47 of Orientia tsutsugamushi

Orientia tsutsugamushi (OT), ein obligat intrazelluläres, Gram-negatives Bakterium aus der Familie der Rickettsiaceae, repliziert im Zytosol. Unter seinen Oberflächen- und periplasmatischen Proteinen ist jedoch die Rolle des typ-spezifischen Antigens von 47 kD (TSA47) unvollständig verstanden. Diese Forschungsarbeit etablierte ein Protein-Überexpressionssystem in eukaryontischen Wirtszellen und untersuchte die Rolle von TSA47 in drei verschiedenen Aspekten der Wirts-Pathogen-Interaktion. Zunächst wurde das TSA47-Gen für die Expression in Säugetieren kodon-optimiert und in den pCAGGS-Hochexpressionsvektor kloniert. Um die Proteine mittels Mikroskopie und Western Blot detektieren zu können, wurden sie mit FLAG/myc-Tags versehen (F47M). Dieses System wurde für Experimente in menschlichen Hepatomazellen, der HuH7-Zelllinie, verwendet. Zuerst wurde in der Studie untersucht, wie sich die Expression von TSA47 auf die Integrität der Zytoskelettkomponenten des Wirts auswirkt, da TSA47 eine hohe Homologie zur menschlichen Serinprotease A1 (HtrA1) aufweist, ein bekanntermaßen Mikrotubuli-assoziiertes Protein (MAP). Durch kinetische Studien mit TSA47-Überexpression wurde festgestellt, dass TSA47 zelluläres α-Tubulin sequestriert und die Integrität der Mikrotubuli in HuH7-Zellen beeinträchtigt. Zusätzlich wurde festgestellt, dass eine Nocodazol-Behandlung, die die Mikrotubuli destabilisiert, die TSA47-α-Tubulin-Assoziation erhöht. TSA47 enthält 4 Domänen, nämlich das Signalpeptid, die Serin-Protease- sowie die PDZ1- und PDZ2-Domänen. Es wurde auch gezeigt, dass bei Überexpression einer PDZ2-Deletionsmutante (M47ΔP) die Rekrutierung von α-Tubulin abnimmt. Beim Pull-down von überexprimiertem TSA47 aus HuH7-Zellen wurde interessanterweise keine Ko-Immunpräzipitation von α-Tubulin mit diesem gefunden. In einem Live-OT-Infektionsmodell in HuH7-Zellen, sowohl früh (48h) als auch spät (72h), hat OT nicht direkt mit Tubulin interagiert oder die Integrität des Mikrotubuli-Netzwerkes deutlich verändert. Weiterhin untersuchte die vorliegende Studie die überexprimierte Form von TSA47 mittels Western Blot. Es wurde festgestellt, dass TSA47 Homo-Oligomere mit einem hohen Molekulargewicht ≥ 250 kD bildet. Da oligomere Formen exogener Proteine die sog. Aggrephagie durch Beteiligung des Zelladapterproteins p62 auslösen, wurde auch TSA47 untersucht und eine Assoziation mit p62 in HuH7-Zellen gefunden. Zuletzt wurde die Rolle von OT in der Wechselwirkung mit der Replikation von Influenza A-Viren (IAV) [A/Hamburg/05/2009(H1N1)] untersucht. TSA47 weist eine hohe Homologie zur HtrA1 in der Trypsin-ähnlichen Serinprotease-Domäne auf, und es ist bekannt, dass die Spaltung von Hämagglutinin (HA) aus IAV durch Serinproteasen für dessen Ausbreitung und Replikation in Hostzellen unverzichtbar ist. Daher wurde der Einfluss einer OT-Infektion auf die Ausbreitung und Replikation von IAV in OT-infizierten MDCK II-Zellen gemessen. Es wurde festgestellt, dass eine Infektion mit OT die Replikation von IAV in Abwesenheit einer exogenen Protease erhöht. Bei Koexpression von HA aus demselben IAV und TSA47 in HEK293T-Zellen erwies sich TSA47 jedoch als nicht in der Lage, das HA zu spalten. Zusammenfassend zeigten diese Ergebnisse, dass OT über bislang unbekannte Faktoren die Ausbreitung von IAV in Wirtszellen unterstützt. Insgesamt lieferte diese Arbeit mit Hilfe des neu etablierten Überexpressionssystems neue Erkenntnisse über die Rolle von TSA47, z.B. als sezerniertes Protein, in der Wirts-Pathogen-Interaktion von OT, v.a. in dessen Interaktion mit dem Zytoskelett.