Investigation of the role of the mitochondrial ABC transporter ABCB7 in heme and iron-sulfur protein biosynthesis

Mutationen im Gen, das für den menschlichen mitochondrialen Transporter ABCB7 kodiert, stehen in Zusammenhang mit den Krankheiten X-chromosomale sideroblastische Anämie mit zerebellärer Ataxie sowie refraktäre Anämie mit Ringsideroblasten. ABCB7 ist in der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert und gilt als Exporteur von schwefelhaltigen Verbindungen, die für die zytosolische und nukleäre Eisen-Schwefel-Proteinbiogenese entscheidend sind. Ebenfalls haben einige frühere Studien in ABCB7-depletierten Zellen auch einen Mangel an hämhaltigen Proteinen nachgewiesen. Die genauen molekularen Mechanismen, die dieser Beobachtung zugrunde liegen, sind nach wie vor unklar. Diese Beobachtungen warfen die Frage nach einer direkten Beteiligung von ABCB7 sowohl an der Hämbiosynthese als auch am mitochondrialen Hämexport auf, mit möglichen Konsequenzen für die Erythropoese. Zusätzlich dazu könnten verschiedene zytosolisch-nukleäre Eisen-Schwefel-Proteine, die eine zentrale Rolle im zellulären Eisen- und Hämstoffwechsel spielen, die assoziierten Phänotypen der Patienten erklären. Andere Studien deuten auf physikalische und funktionelle Wechselwirkungen zwischen ABCB7 und der Ferrochelatase hin, einem Enzym, das mit der Matrixseite der inneren Mitochondrienmembran assoziiert ist und den letzten Schritt der Hämbiosynthese vermittelt. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Rolle von ABCB7 bei der Reifung von Hämoproteinen in menschlichen Zellen zu charakterisieren. Um eine mögliche mitochondriale Hämexportfunktion von ABCB7 zu untersuchen, wurde ein HeLa-Zellkultursystem etabliert, in dem das peroxisomale, hämhaltige Enzym Katalase überexprimiert wurde. In diesem System wurde ABCB7 mittels RNA-Interferenz depletiert. Über die Messung von Enzymaktivitäten und Immunoblotting an mitochondrialen und zytosolischen Zellfraktionen wurden Effekte auf die Bildung und den mitochondrialen Export von Häm ermittelt. Diese wurden mit einem analogen Zellsystem verglichen, in dem die für die Hämbiosynthese essenzielle Ferrochelatase mittels RNA-Interferenz depletiert wurde. Darüber hinaus wurde die Synthese ausgewählter mitochondrialer sowie zytosolischer und nukleärer Eisen-Schwefel-Proteine untersucht, um die Rolle von ABCB7 in der Eisen-Schwefel-Proteinbiosynthese zu ermitteln. Nach Depletion von ABCB7 oder Ferrochelatase ging die erreichte Zellzahl deutlich zurück, was die Bedeutung sowohl von ABCB7 als auch der Ferrochelatase für Wachstum und Zellteilung zeigte. Die Depletion der Ferrochelatase wirkte sich speziell auf die Stabilität und Funktion von Hämoproteinen innerhalb und außerhalb der Mitochondrien aus, darunter der Atmungskettenkomplex II, das Cytochrom c1 des Atmungskettenkomplexes III, der Atmungskettenkomplex IV und Katalase. Im Gegensatz dazu beeinträchtigte ein Mangel an ABCB7 die Stabilität und Funktion von Hämoproteinen wie die Katalase-Aktivität nicht signifikant, was eindeutig darauf hindeutete, dass ABCB7 keine Rolle beim Hämexport aus den Mitochondrien und der anschließenden Reifung von extramitochondrialen Hämoproteinen spielt. Darüber hinaus konnte in der vorliegenden Studie keine Rolle von ABCB7 für mitochondriale Hämproteine identifiziert werden, was gegen einen funktionellen Einfluss des Transporters auf die Hämbildung durch Ferrochelatase spricht. Vielmehr führte der Verlust von ABCB7 zu einer beeinträchtigten Reifung von zytosolischen und nukleären Eisen-Schwefel-Proteinen, darunter GPAT, DPYD und NTHL1, drei Enzyme, die am Nukleotidstoffwechsel und an der DNA-Reparatur beteiligt sind, sowie des iron-regulatory proteins 1. Insgesamt bestätigten die Ergebnisse frühere Befunde, die auf die Notwendigkeit von ABCB7 für die zytosolische und nukleäre Eisen-Schwefel-Clusterbiosynthese hingewiesen hatten. Der ABCB7-Mangel beeinflusste auch die Spiegel zweier Proteine der zellulären Eisen-Homöostase, des Eisenspeicherproteins Ferritin und des Transferrinrezeptors, was zum Phänotyp eines zellulären Eisenmangels führte. Der ABCB7-Mangel führte zusätzlich zu einem Anstieg eines Markers für eine erhöhte mitochondriale Eisenaufnahme auf Kosten des zytosolischen Kompartiments. Darüber hinaus führte die RNA-Interferenz-vermittelte Depletion von ABCB7 zu Defekten bei mitochondrialen Eisen-Schwefel-Proteinen, die mutmaßlich durch den veränderten Eisenstoffwechsel verursacht wurden. Insgesamt widerlegte die aktuelle Untersuchung eindeutig eine Rolle des humanen ABCB7 sowohl bei der mitochondrialen Hämsynthese als auch beim Hämexport in das Zytosol. Die direkte Beteiligung von ABCB7 an der Erythropoese scheint somit fragwürdig. In Übereinstimmung mit früheren Studien über ABCB7-Orthologa aus mehreren Modellorganismen wurde festgestellt, dass ABCB7 für die Biogenese von zytosolisch-nukleären Eisen-Schwefel-Proteinen unabdingbar ist. Zelluläre Prozesse, an denen diese Eisen-Schwefel-Proteine beteiligt sind, wie der Eisenstoffwechsel, die Genomintegrität und die Proteinbiosynthese, sind bei ABCB7-Mangel ebenfalls betroffen. Sie tragen zum komplexen Phänotyp von Patienten mit X-chromosomaler sideroblastischer Anämie mit zerebellärer Ataxie sowie refraktärer Anämie mit Ringsideroblasten bei. Die gleichzeitigen, jedoch schwächer ausgeprägten Auswirkungen eines ABCB7-Mangels auf mitochondriale Eisen-Schwefel-Proteine wurden möglicherweise durch oxidativen Stress verursacht, der aus einer in ABCB7-defizienten Zellen beobachteten Eisenakkumulation resultierte. Ähnliche pathologische Mechanismen könnten auch bei anderen Krankheiten mit Eisenüberladung wie der Friedreich-Ataxie (verursacht durch Frataxin-Mangel) und der sideroblastischen Anämie 3 (verursacht durch GLRX5-Mangel) wirksam sein.