Control of cellular trafficking of mammalian voltage sensitive phosphatase (VSP) through protein-protein interactions

Spannungsemfindliche Phosphatasen (VSPs) weisen eine einzigartige Kombination aus einer Spannungssensordomäne (VSD), ähnlich der VSP spannungsabhängiger Ionenkanäle (VGICs), und einer katalytischen Domäne, homolog zum Tumorsuppressorprotein PTEN auf. Ihre Fähigkeit auf Membranspannung zu reagieren, in Verbindung mit ihrer Lipidphosphatase-Aktivität macht VSPs zu außergewöhnlichen Signalproteinen, die infolge einer Depolarisation der Zellmembran, Phoshoinositid-Lipide (PIs) konvertieren. Es ist bekannt, dass VSPs elektrische Signale auf diese Weise unmittelbar in intrazelluläre biochemische Signale umwandeln können. VSPs existieren in mehreren Spezies, allerdings ist ihre physiologische Rolle, von einer Beteiligung an der Regulation der Spermienmotilität in Säugetieren abgesehen, bisher weitestgehend ungeklärt. Die spannungsabhängige Phosphatase-Aktivität einiger Nicht-Säugetier-VSPs (z.B. aus Ciona intestinalis, CiVSP) gegenüber PIs konnte dank robuster Expression und Lokalisation in der Plasmamembran (PM) in heterologen Expressionssystemen bereits charakterisiert werden. Im Gegensatz dazu sind Säugetier-VSPs wenig erforscht, da sie die PM bei heterologer Expression nicht erreichen. Daher blieb bisher unklar, ob sie überhaupt spannungsabhängige Phosphatase-Aktivität aufweisen. Zusätzlich erschwerte das Fehlen eines verlässlichen Antikörpers die Aufklärung der physiologischen Rolle von VSPs in ihrem natürlichen Kontext. Ziel meiner Dissertation war, ein Screeningverfahren zur Identifizierung von Protein-Interaktionspartnern der VSP der Maus durchzuführen, um die Mechanismen des zellulären Proteins-Transports und der subzellulären Lokalisation aufzuklären. Dies sollte es dann ermöglichen, die elektrochemische Funktion der mVSP in Überexpressionssystemen zu untersuchen. Unter Verwendung eines Membran-basierten Yeast-Two-Hybrid-Screens konnten wir das Single-Transmembrane-Domain-Protein Basigin (BSG) als einen potentiellen Protein-Protein-Interaktionspartner von mVSP identifizieren. In Co-Expressionsexperimenten in Zellkultur konnten wir zeigen, dass BSG eine assoziierte Protein-Untereinheit von mVSP ist, die den Transport vom endoplasmatischen Retikulum (ER) zur PM vermittelt. Der Transport zur PM konnte ebenfalls durch Assoziation mit den homologen Proteine der BSG-Familie vermittelt werden, namentlich Neuroplastin (NPTN) und Embigin (EMB). Um ein tieferes Verständnis der molekularen Domänen von BSG zu erlangen, die am PM-Targeting von mVSP beteiligt sind, bedienten wir uns eines Mutationsansatzes. Unsere Untersuchungen zeigten, dass die Transmembranregion von BSG ausreichend ist, um den Transport von mVSP zur PM zu ermöglichen. Komplementär dazu untersuchten wir die Regionen von mVSP, die die ER-Lokalisation in Abwesenheit von BSG determinieren. Wir konnten sowohl N- als auch C-terminale Sequenzabschnitte von mVSP identifizieren, die kooperativ für die ER- verantwortlich sind. Der BSG-vermittelte Transport an die PM, ermöglichte es schließlich, die Aktivität der mVSP als spannungsaktivierte Lipidphosphatase nachzuweisen. Wir konnten feststellen, dass mVSP eine durch Depolarisation des Membranpotentials aktivierte 5'-Phosphatase der Substrate PI(4,5)P2 und PI(3,4,5)P3 darstellt. Bemerkenswerterweise wurde zuvor bereits die Lokalisation von mVSP wie auch BSG im Flagellum der Spermien gezeigt und mit der Regulierung der Spermienmotilität in Verbindung gebracht. Unsere Ergebnisse legen dementsprechend eine essentielle Rolle von BSG für den Transport von mVSP in die PM des Spermiums nahe. Dies wiederum ist die Versaussetzung für eine Kontrolle der Spermienmotilität über die Modulation des PI-Metabolismus.