Development and characterization of new tools for advanced SMLM imaging schemes

Die Fluoreszenzmikroskopie hat sich in den Lebenswissenschaften als wichtige Technik zum Verst¨andnis von biologischen Strukturen und Prozessen etabliert, da sie eine kontrastreiche Bildgebung erm¨oglicht und ein umfangreiches Repertoire an verschiedenen Fluoreszenzmarkern und Markierungstechniken zur Verf¨ugung stellt, um ein Zielmolek¨ul gezielt zu markieren, und sie erm¨oglicht Bildgebungsexperimente, die mit lebenden und fixierten Zellen kompatibel sind. Um Strukturen aufzul¨osen, welche kleiner als 200 nm sind, was der Beugungsgrenze des Lichts entspricht, sind anspruchsvollere Methoden erforderlich. Techniken wie die Elektronenmikroskopie bieten zwar die notwendige Aufl¨osung, jedoch nicht den Kontrast und die Kompatibilit¨at mit lebenden Zellen, welche die Fluoreszenzmikroskopie wiederum bietet. Um daher die Beugungsgrenze des Lichts zu umgehen und die vorher genannten Vorteile der Fluoreszenzmikroskopie nutzen zu k¨onnen, wurden Hochaufl¨osungsmikroskopie-Techniken entwickelt, welche besondere Ausleuchtungsmuster und Fluorophore mit kontrollierbarer Photophysik verwenden. Hierbei hat besonders die Einzelmolek ¨ul-Lokalisationsmikroskopie den Anwendungshorizont der Hochaufl¨osungsmikroskopie erheblich erweitert, da sie ausgiebig zur qualitativen und quantitativen Analyse der r¨aumlichen Organisation und molekularen Dynamik von intrazellul¨arer Strukturen und Prozesse angewendet wurde. Nichtsdestotrotz ist die Anwendung der Einzelmolek¨ul-Lokalisationsmikroskopie auch mit einigen Nachteilen verbunden, welche ber¨ucksichtigt werden m¨ussen. Die Qualit¨at der mikroskopischen Aufnahmen und damit der biologischen Ergebnisse kann z.B. durch die Verwendung der ben¨otigten hohen Laserintensit¨aten, die zu phototoxischen Sch¨aden in der biologischen Probe f¨uhren k¨onnen, durch Heterogenit¨at im Beleuchtungsmuster und durch Probendrift beeintr¨achtigt werden. Diese Probleme f¨uhren zu einem Bedarf an Methoden, um eine robuste und pr¨azise Driftkorrektur zu gew¨ahrleisten und die Bestrahlungsintensit¨at und die Homogenit¨at der Ausleuchtung direkt auf Probenniveau zu bestimmen. Daher wurden in Kapitel 2 neue Methoden und Strategien entwickelt, um diese Probleme zu l¨osen. Pr¨azise und robuste Driftkorrektur basierend auf Referenzmarkern erfordert die Verwendung monodisperser fluoreszierender Referenzmarker, welche der mikroskopischen Bildaufnahme ein stabiles Fluoreszenzsignal aufweisen, welches deutlich heller ist als das Signal des Zielfluorophors. Daher wurde zun¨achst die Leistung von h¨aufig verwendeten Referenzmarkern bewertet und anschließend eine neue Strategie f¨ur die Driftkorrektur basierend auf Referenzmarkern entwickelt. Bei g¨angigen Referenzmarkern, wie TetraSpeck-Marker oder Gold-Nanopartikel, bleichte oder fluktuierte w¨ahrend der Bildaufnahme, sie bildeten Aggregate oder waren nicht viel heller als das Zielfluorophor und lieferten eine ungenaue Driftkorrektur. Daher wurde eine neue Strategie entwickelt, bei der fluoreszierende Referenzmarker verwendet werden, die mit einem fluoreszierenden Farbstoff beschichtet sind, welcher spektral rotverschoben ist im Vergleich zum Auslesekanal des Zielfluorophors. Dadurch, dass der Farbstoff auf dem Referenzmarker in dem Auslesekanal nur eine geringe Ausleseeffizienz aufweist, durch die hohe Anzahl an Farbstoffmolek¨ulen trotzdem hell genug ist, kann ein ausreichend helles und stabiles Fluoreszenzsignal und damit eine pr¨azisere Driftkorrektur erreicht werden. Diese Strategie wurde dann erweitert, indem ein neuer Referenzmarker entwickelt wurde, welcher auch als Fluoreszenz-Helligkeitsstandard auf Probenniveau dienen kann, da er eine definierte Struktur und Anzahl an gebundenen Farbstoffmolek¨ulen vorweist. Um sowohl ein stabiles Fluoreszenzsignal als auch eine definierte Struktur und Anzahl von Farbstoffen zu gew¨ahrleisten, wurden die Konzepte der DNA-Origami-Technik und der Einzelmolek¨ul-Lokalisationsmikroskopie-Technik DNA-PAINT kombiniert, indem ein DNA-Origami-Konstrukt mit einer definierten Anzahl von Bindungsstellen verwendet wird, an welches der Farbstoff transient binden kann, da er an einen kurzen, zur Bindungsstelle komplement¨aren DNA-Strang gebunden ist. Durch Anpassen der Farbstoffkonzentration und des Salzgehalts des Puffers war es m¨oglich, eine quasi-konstante und vollst¨andige Markierung des DNA-Origamis zu gew¨ahrleisten, was zu einem stabilen Fluoreszenzsignal f¨uhrte. Schließlich wurde in Kapitel 3 die Einzelmolek¨ul-Lokalisationsmikroskopie-Technik sptPALM als geeignete Methode zur Aufkl¨arung der molekularen Dynamik und der Wechselwirkungen einzelner Proteine und Proteinkomplexe in lebenden Zellen eingesetzt und etabliert, wobei das Typ-IIISekretionssystem (T3SS) in Yersinia enterocolitica und seine Komponenten im Fokus standen. Das T3SS ist ein nadelf¨ormiger Multiproteinkomplex, welcher von zahlreichen pathogenen Bakterien zur Interaktion und Manipulation von Wirtszellen verwendet wird, indem sie molekulare Toxine, sogenannte Effektorproteine, sekretieren. Obwohl die Struktur des T3SS bereits ausgiebig erforscht wurde, ist ¨uber dessen Regulierung und Funktion bisher nur wenig bekannt. Daher wurde sptPALM verwendet, um zwei Subkomplexe des T3SS in lebenden Y. enterocolitica- Zellen zu untersuchen: die Interaktion zwischen den zytosolischen Komponenten des T3SS und den Effektorproteinen im Zytosol, sowie die pH-abh¨angige Diffusion und Anlagerung des Membran-Ankerproteins SctD. Durch die Auswertung des Diffusionsprofils der Hauptkomponente der zytosolischen Komponenten SctQ in An- und Abwesenheit von Effektorproteinen und sowohl unter nicht-sekretierenden als auch unter sekretierenden Bedingungen, konnte die Interaktion zwischen den zytosolischen Komponenten und Effektorproteinen gezeigt werden, welche aufgrund der transienten Art der Interaktion mit herk¨ommlichen Proteininteraktionsstudien schwer nachzuweisen ist. Außerdem wurde gezeigt, dass die Anwesenheit von Effektoren und die Sekretionsbedingungen die Gesamtzusammensetzung der zytosolischen Komponenten beeinflussen. Das Diffusionsprofil des inneren Membranproteins SctD zeigte, dass SctD bei niedrigen externen pH-Werten teilweise von der Membran dissoziiert, was jedoch durch Wiederherstellung eines neutralen externen pH-Wertes wieder vollst¨andig umgekehrt werden konnte. Diese Beobachtung deutet stark auf eine regulatorische Funktion hin, da die teilweise Dissoziation von SctD bei niedrigem pH-Wert die Effektorsekretion z.B. im Magen verhindern w¨urde, w¨ahrend die Wiederherstellung eines neutralen pH-Werts eine schnelle Aktivierung des Sekretionvorgangs in der Zielregion der Infektion erm¨oglichen w¨urde. Da dieses Verhalten nur bei gastrointestinalen Pathogenen, wie z.B. Y. enterocolitica und S. flexneri und nicht bei pathogenen Bakterien mit anderen Infektionswegen, wie z.B. P. aeruginosa, festgestellt wurde, st¨arkt dies die Hypothese, dass dieser Mechanismus gastrointestinalen pathogenen Bakterien einen physiologischen Vorteil durch Energiekonservierung bei niedrigem externen pH-Wert bietet.